霉酚酸對(duì)骨髓干細(xì)胞作用及霉酚酸作用靶點(diǎn)的基因多態(tài)性研究.pdf

1、霉酚酸(MPA)是霉酚酸酯(MMF)在體內(nèi)代謝后的活性成分，其作用靶點(diǎn)是次黃嘌呤核苷酸脫氫酶(IMPDH)，通過(guò)特異性抑制IMPDH，可以耗竭細(xì)胞內(nèi)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷酸，進(jìn)而阻斷DNA和RNA的合成。淋巴細(xì)胞高度依賴(lài)嘌呤從頭合成途徑，所以對(duì)MPA作用非常敏感。MMF做為一種強(qiáng)效安全的免疫抑制劑，目前廣泛應(yīng)用于實(shí)體臟器移植和異基因造血干細(xì)胞移植。在異基因造血干細(xì)胞移植中，MMF廣泛用于預(yù)防排斥反應(yīng)和急性移植物抗宿主病，也用于治療

2、移植物抗宿主病。而在異基因造血干細(xì)胞移植中，骨髓中的兩種干細(xì)胞-造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞起著極其重要的作用。造血干細(xì)胞是異基因造血干細(xì)胞移植中重建造血和免疫的種子細(xì)胞，而間充質(zhì)干細(xì)胞不僅是造血微環(huán)境的重要組成細(xì)胞，而且是近年來(lái)異基因造血干細(xì)胞移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞共移植可以促進(jìn)造血植入、降低移植物抗宿主病的發(fā)生，而且間充質(zhì)干細(xì)胞還用于治療激素耐藥重度急性GVHD，Ⅱ期臨床研究顯示了良好的應(yīng)用前景。MMF對(duì)這兩種骨髓

3、干細(xì)胞有什么作用？MMF應(yīng)用的一個(gè)明顯的不良反應(yīng)是血液系統(tǒng)毒性，是不是與MMF對(duì)造血于細(xì)胞的作用有關(guān)？目前的相關(guān)研究還不能解釋該問(wèn)題。本研究旨在研究MPA對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞的作用，并探索其作用的機(jī)制，為臨床更好應(yīng)用MMF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。MPA的作用靶點(diǎn)是IMPDH酶，IMPDH酶有兩種亞型：IMPDHⅠ和IMPDHⅡ，IMPDHⅠ組成性表達(dá)于所有細(xì)胞，而IMPDHⅡ表達(dá)于部分細(xì)胞，與細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。IMPDHⅠ在胞內(nèi)嘌呤

4、合成中起主要作用，也是MPA作用的主要靶點(diǎn)。IMPDHⅠ單核苷酸多態(tài)性(SNP)近來(lái)引起研究的關(guān)注，Wang等報(bào)道在腎臟移植中患者IMPDHⅠ基因單核苷酸多態(tài)性與腎臟排斥反應(yīng)相關(guān)。IMPDHⅠ單核苷酸多態(tài)性會(huì)不會(huì)影響MPA在異基因造血干細(xì)胞移植中的作用？我們選擇了IMPDHⅠ基因在腎臟移植中與急性移植物失功相關(guān)的單核苷酸突變位點(diǎn)和在中國(guó)人群中突變發(fā)生率在20％以上的共4個(gè)單核苷酸突變位點(diǎn)，收集本骨髓移植中心自2001年至2009年移植供

5、受者的基因組DNA，檢測(cè)供受者IMPDHⅠ基因單核苷酸多態(tài)性的分布頻率，并分析其與異基因造血干細(xì)胞移植急性移植物抗宿主病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。第一章霉酚酸對(duì)入骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞作用研究
　　 本部分研究首先采用CCK-8方法分析霉酚酸對(duì)人骨髓來(lái)源的MSCs增殖的影響。結(jié)果顯示：濃度1μmol/L-100μmol/L的MPA對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且其抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間濃度依賴(lài)效應(yīng)。為研究MPA抑制MSCs增殖的機(jī)制，我們?cè)?/p>

6、培養(yǎng)體系內(nèi)添加鳥(niǎo)嘌呤核苷(Guo，100pmol/L)，結(jié)果顯示鳥(niǎo)嘌呤核苷逆轉(zhuǎn)了MPA的抑制增殖作用，加Guo組與相應(yīng)濃度的MPA組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)我們用AnnexinV流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)MPA各濃度組的凋亡情況，在作用的48小時(shí)和7天時(shí)間，10μmol/L和100μmol/L MPA濃度組的凋亡情況與相應(yīng)對(duì)照組相仿(P>0.05)，表明MPA不誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞凋亡。接下來(lái)我們用CCK-8方法檢測(cè)T-淋巴細(xì)胞

7、、成纖維細(xì)胞和MSCs對(duì)MPA作用的敏感性，結(jié)果顯示在作用的第6天上述各組細(xì)胞的IC50分別為0.20μmol/L、1.54μmol/L和2.47μmmol/L。為了揭示MSCs、成纖維細(xì)胞對(duì)MPA作用敏感的原因，我們用RT-PCR方法分析這兩種細(xì)胞IMPDHⅠ和IMPDHⅡ的表達(dá)情況，結(jié)果顯示這兩種細(xì)胞均表達(dá)IMPDHⅠ和IMPDHⅡ。
　　 接下來(lái)我們研究MPA對(duì)MSCs成骨分化、成脂分化和成軟骨分化的影響。Vonkossa

8、染色和鈣定量顯示MPA抑制MSCs的成骨分化，real-time PCR方法定量分析Osteopontin和BMP-2的表達(dá)，二者表達(dá)也呈劑量依賴(lài)性降低。添加鳥(niǎo)嘌呤核苷(100μmol/L)則逆轉(zhuǎn)了MPA對(duì)MSCs成骨分化的抑制。為進(jìn)一步研究MPA抑制MSCs成骨分化的具體機(jī)制，我們用real-time PCR方法定量檢測(cè)Runx2、Osterix和ATF4，結(jié)果顯示Runx2、Osterix在誘導(dǎo)7天和14天表達(dá)均降低，western

9、-blot證實(shí)二者蛋白表達(dá)降低，添加Guo后表達(dá)得到恢復(fù)。MPA對(duì)MSCs成脂分化沒(méi)有影響，油紅O染色顯示MPA各濃度組成脂出現(xiàn)，脂滴定量顯示MPA各濃度組與對(duì)照組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，real-time PCR檢測(cè)adipophilin和leptin顯示，MPA作用下二者表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有差別(P>0.05)。蕃紅O染色和real-time PCR方法定量檢測(cè)aggrecan和collagenⅡ顯示MPA對(duì)MSCs成軟骨分化沒(méi)

10、有影響。第二章霉酚酸對(duì)人造血干祖細(xì)胞作用研究
　　 集落形成細(xì)胞（colony-forming cell，CFC）是評(píng)估造血細(xì)胞功能的實(shí)驗(yàn)室金標(biāo)準(zhǔn)，是用來(lái)檢測(cè)造血干祖細(xì)胞增殖分化的功能指標(biāo)。本部分研究首先探討MPA對(duì)造血干祖細(xì)胞集落形成的影響。在MPA濃度0.1-5μmol/L濃度范圍內(nèi)，MPA對(duì)集落細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞集落形成單位數(shù)目(CFU-E)、爆式紅細(xì)胞集落形成單位數(shù)目(BFU-E)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞形成單位數(shù)目(CFU-G

11、M)均無(wú)影響，在10μmol/L時(shí)上述細(xì)胞集落總數(shù)和各系集落數(shù)目開(kāi)始降低(P<0.05)，50和100μmol/L時(shí)幾乎消失；粒細(xì)胞-紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落形成單位數(shù)目(CFU-GEMM)則從5μmol/L時(shí)開(kāi)始減少(P<0.05)，50和100μmol/L時(shí)消失。在MPA各濃度組添加鳥(niǎo)嘌呤核苷(200μmol/L)，集落細(xì)胞總數(shù)、CFU-E、BFU-E和CFU-GM數(shù)目均得到恢復(fù)(P<0.05)；對(duì)CFU-GEMM來(lái)說(shuō)，10μ

12、mol/L組添加Guo組得到恢復(fù)，而50和100μmol/L組添加Guo未得到恢復(fù)，這可能與CFU-GEMM在誘導(dǎo)體系中數(shù)目較少有關(guān)。這說(shuō)明Guo可以逆轉(zhuǎn)MPA對(duì)造血干細(xì)胞集落形成的抑制。為進(jìn)一步檢測(cè)MPA對(duì)造血干祖細(xì)胞的作用，采用7-AAD/AnnexinV、CD34染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34+細(xì)胞細(xì)胞的凋亡情況。培養(yǎng)48小時(shí)后，10μmol/L組和100μmol/L組CD34+細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)分別為5.26士0.95和3.5

13、8士0.93，與對(duì)照祖4.78士1.46％相仿(P>0.05)；培養(yǎng)96小時(shí)后，10μmol/L組和100μmol/L組CD34+細(xì)胞中凋亡細(xì)胞分別為15.44士1.81和16.01士2.73，與對(duì)照祖13.77士3相仿(P>0.05)。說(shuō)明MPA不能引起CD34+細(xì)胞發(fā)生凋亡。第三章Ⅰ型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶的基因多態(tài)性在異基因造血干細(xì)胞移植急性移植物抗宿主病中的作用研究
　　 目前MMF在異基因造血干細(xì)胞移植中廣泛應(yīng)用于預(yù)防和

14、治療aGVHD，而研究已證實(shí)個(gè)體間IMPDH的活性存在存在較大差異，因此我們?cè)O(shè)想IMPDHⅠ基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能影響IMPDH的活性，導(dǎo)致個(gè)體間MMF作用的差異，可能與GVHD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。我們選擇本移植中心自2001年1月至2009年3月連續(xù)續(xù)受異基因造血干細(xì)胞移植的患者及其供者，共240對(duì)。其中包括接受無(wú)關(guān)供者移植(URD)的患者及其供者138對(duì)，接受HL

15、A全相合同胞供者移植(Sib)的患者及其供者102對(duì)。留取供者和患者移植前外周血樣，提取基因組DNA，我們選擇檢測(cè)文獻(xiàn)報(bào)道IMPDHⅠ基因在腎臟移植中與急性移植物失功相關(guān)的SNP位點(diǎn)和在中國(guó)人群中突變發(fā)生率在20％以上的共4個(gè)SNP位點(diǎn)：內(nèi)含子7(IVS7)+125 G>A(rs2278293)；內(nèi)含子8(IVS8)-106G>A(rs2278294)；外顯子15(Exon15)1572G>A(rs2228075)和5側(cè)翼序列C>T(r

16、s714510)，分析其與異基因造血干細(xì)胞移植急性移植物抗宿主病的關(guān)系。我們的結(jié)果證實(shí)患者在IMPDHⅠ基因IVS8-106位點(diǎn)為G/G基因型的aGVHD的發(fā)生率明顯高于基因型為A/A和G/A的患者，多因素分析亦證實(shí)患者在IMPDHⅠ基因IVS8-106位點(diǎn)為G/G基因型是aGVHD發(fā)生的危險(xiǎn)因素((RR=2.018，95％CI:1.354-3.009，P=0.001)。本研究未發(fā)現(xiàn)其他3個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與aGVHD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可