全外顯子組數(shù)據(jù)分析研究及在肝細胞肝癌中的相關應用.pdf

1、目的:
　　利用全外顯子組測序技術，可以無偏倚的識別肝細胞肝癌蛋白質編碼區(qū)中的基因突變。目前利用下一代測序技術研究肝細胞肝癌的報道還較少，并且在原始數(shù)據(jù)分析中尚無一個標準的分析流程可供參照。因此本研究先比較全外顯子組測序分析流程中不同的預處理方法和變異識別方法，再根據(jù)比較后的結論構建體細胞突變識別的流程，并在公開的肝細胞肝癌外顯子組數(shù)據(jù)中進行運用。我們試圖通過本研究，為將來研究病毒相關性肝癌的突變模式、尋找驅動突變進行前期準備，建

2、立實驗框架。
　　方法:
　　1.利用兩例全外顯子組測序數(shù)據(jù)，從使用不同的預處理方法（FASTX-Toolkit、Trimmomatic及未做預處理），修飾后不同的不成對讀長（Single-end reads，SE）取舍策略，以及兩種不同的變異過濾方法(Hard過濾和變異質量得分重校正(variant quality score recalibration，VQSR))三個方面，通過數(shù)據(jù)覆蓋深度（Depth of Cover

3、age，DP）、識別變異的數(shù)目、轉換/顛換率(Transition/transversion ratio，Ti/Tv)和基因型一致性等特征，比較這些因素對全外顯子組變異識別結果影響。
　　2.根據(jù)全外顯子組數(shù)據(jù)分析流程，構建腫瘤組織體細胞突變識別流程。我們選擇了用于識別體細胞點突變的MuTect程序以及識別體細胞插入和缺失變異的SomaticIndelDetector程序。
　　3.以10組公開的HBV相關肝細胞肝癌癌組織和

4、癌旁正常組織的外顯子組測序數(shù)據(jù)為實驗對象，利用已建立的腫瘤組織體細胞突變識別流程對其進行分析，研究其體細胞突變的情況，并用IPA對識別到的突變基因進行功能途徑分析。
　　結果:
　　1.Trimmomatic預處理后的讀長的測序覆蓋深度與未預處理的原始數(shù)據(jù)接近，但明顯高于FASTX-Toolkit預處理方法。當DP≥10×、基因型質量分值（Genotype Quality Score，GQ）≥20時，經(jīng)Trimmomatic

5、預處理后識別到的單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV）數(shù)量比FASTX-Toolkit多，與未預處理組接近。當包含SE讀長時，F(xiàn)ASTX-Toolkit組多識別出的SNV數(shù)量高于(28％)Trimmomatic組(5％)。當樣本量較少時，在所有試驗組中Hard過濾方法濾掉的SNV要少于VQSR。
　　2.HBV相關肝細胞肝癌未經(jīng)預處理直接與參考序列比對后，實際平均測序深度為9.76×-19.02

6、×。共識別出926個基因發(fā)生了1100個非沉默的體細胞點突變，34個基因發(fā)生了34個體細胞性插入和缺失。IPA功能途徑分析表明構建的網(wǎng)絡與癌癥相關，并且與GADD45信號通路(P=5.42E-03)、脂肪酸β氧化Ⅲ途徑（Fatty Acid b-oxidationⅢ）(P=6.31E-03)、乙醇氧化降解途徑（Oxidative Ethanol DegradationⅢ）(P=6.85E-03)有關。
　　結論:
　　1.T