全外顯子組數(shù)據(jù)分析研究及在肝細(xì)胞肝癌中的相關(guān)應(yīng)用.pdf

1、目的:
　　利用全外顯子組測序技術(shù)，可以無偏倚的識別肝細(xì)胞肝癌蛋白質(zhì)編碼區(qū)中的基因突變。目前利用下一代測序技術(shù)研究肝細(xì)胞肝癌的報(bào)道還較少，并且在原始數(shù)據(jù)分析中尚無一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分析流程可供參照。因此本研究先比較全外顯子組測序分析流程中不同的預(yù)處理方法和變異識別方法，再根據(jù)比較后的結(jié)論構(gòu)建體細(xì)胞突變識別的流程，并在公開的肝細(xì)胞肝癌外顯子組數(shù)據(jù)中進(jìn)行運(yùn)用。我們試圖通過本研究，為將來研究病毒相關(guān)性肝癌的突變模式、尋找驅(qū)動突變進(jìn)行前期準(zhǔn)備，建

2、立實(shí)驗(yàn)框架。
　　方法:
　　1.利用兩例全外顯子組測序數(shù)據(jù)，從使用不同的預(yù)處理方法（FASTX-Toolkit、Trimmomatic及未做預(yù)處理），修飾后不同的不成對讀長（Single-end reads，SE）取舍策略，以及兩種不同的變異過濾方法(Hard過濾和變異質(zhì)量得分重校正(variant quality score recalibration，VQSR))三個(gè)方面，通過數(shù)據(jù)覆蓋深度（Depth of Cover

3、age，DP）、識別變異的數(shù)目、轉(zhuǎn)換/顛換率(Transition/transversion ratio，Ti/Tv)和基因型一致性等特征，比較這些因素對全外顯子組變異識別結(jié)果影響。
　　2.根據(jù)全外顯子組數(shù)據(jù)分析流程，構(gòu)建腫瘤組織體細(xì)胞突變識別流程。我們選擇了用于識別體細(xì)胞點(diǎn)突變的MuTect程序以及識別體細(xì)胞插入和缺失變異的SomaticIndelDetector程序。
　　3.以10組公開的HBV相關(guān)肝細(xì)胞肝癌癌組織和

4、癌旁正常組織的外顯子組測序數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)對象，利用已建立的腫瘤組織體細(xì)胞突變識別流程對其進(jìn)行分析，研究其體細(xì)胞突變的情況，并用IPA對識別到的突變基因進(jìn)行功能途徑分析。
　　結(jié)果:
　　1.Trimmomatic預(yù)處理后的讀長的測序覆蓋深度與未預(yù)處理的原始數(shù)據(jù)接近，但明顯高于FASTX-Toolkit預(yù)處理方法。當(dāng)DP≥10×、基因型質(zhì)量分值（Genotype Quality Score，GQ）≥20時(shí)，經(jīng)Trimmomatic

5、預(yù)處理后識別到的單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV）數(shù)量比FASTX-Toolkit多，與未預(yù)處理組接近。當(dāng)包含SE讀長時(shí)，F(xiàn)ASTX-Toolkit組多識別出的SNV數(shù)量高于(28％)Trimmomatic組(5％)。當(dāng)樣本量較少時(shí)，在所有試驗(yàn)組中Hard過濾方法濾掉的SNV要少于VQSR。
　　2.HBV相關(guān)肝細(xì)胞肝癌未經(jīng)預(yù)處理直接與參考序列比對后，實(shí)際平均測序深度為9.76×-19.02

6、×。共識別出926個(gè)基因發(fā)生了1100個(gè)非沉默的體細(xì)胞點(diǎn)突變，34個(gè)基因發(fā)生了34個(gè)體細(xì)胞性插入和缺失。IPA功能途徑分析表明構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)與癌癥相關(guān)，并且與GADD45信號通路(P=5.42E-03)、脂肪酸β氧化Ⅲ途徑（Fatty Acid b-oxidationⅢ）(P=6.31E-03)、乙醇氧化降解途徑（Oxidative Ethanol DegradationⅢ）(P=6.85E-03)有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.T