GM-CSF與IL-21基因共轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞在裸鼠抗瘤效應(yīng)研究.pdf

1、一、GM-CSF與IL-21基因共轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞及其對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性影響 目的：構(gòu)建小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)與白細(xì)胞介素21(1L-21)基因共表達(dá)載體pRSC-GM-CSF-IL21，將其轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞并觀察其對(duì)NK活性影響。 方法：利用PCR從本室先前構(gòu)建保存的重組質(zhì)粒pRSC-IL21中擴(kuò)增出IL-21基因，再將其插入到另一重組pRSC-GM-CSF質(zhì)粒中，形成pRSC-GM-CSF-

2、lL21共表達(dá)質(zhì)粒(以酶切與測(cè)序鑒定)。用脂質(zhì)體將pRSC-GM-CSF-IL21以及pRSC-GM-CSF、oRSC-IL21與空質(zhì)粒pRSC分別轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3，并將各轉(zhuǎn)染的細(xì)胞依次命名為SKOV3/GM-CSF-IL21、SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL2l及SKOV3/Neo細(xì)胞。用RT-PCR檢測(cè)GM-CSF與IL-21表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)小鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性的影響。 結(jié)果：經(jīng)酶切與

3、測(cè)序鑒定pRSC-GM-CSF-IL21共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL21、SKOV3/GM-CSF-IL21細(xì)胞中有相應(yīng)目的基因GM-CSF、lL-21的表達(dá)。與SKOV3/Neo及SKOV3細(xì)胞相比，SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL2l、SKOV3/GM-CSF-IL2l細(xì)胞上清能夠顯著增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性。 結(jié)論：成功構(gòu)建GM-CSF與lL-21基因共表達(dá)重組質(zhì)粒pRSC-G

4、M-CSF-1L21，并將其轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，表達(dá)的GM-CSF與IL-21能顯著增強(qiáng)小鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性。 二． GM-CSF與IL-21基因共轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)抗瘤效應(yīng)研究 目的：研究GM-CSF與IL-21基因共轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3后的體外影響及在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)。 方法：體外分別培養(yǎng)SKOV3、SKOV3，Neo、SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL21及SKOV3/GM-CSF

5、-IL21細(xì)胞，用倒置相差顯微鏡、MTT比色法及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)觀察各細(xì)胞生長(zhǎng)增殖特性；FCM測(cè)定細(xì)胞表面人類(lèi)白細(xì)胞抗原ABC(HLA-ABC)、MHC I類(lèi)相關(guān)分子(MIC A/B)與細(xì)胞間粘附分子1(ICAM-1)的表達(dá)。將各細(xì)胞分別皮下接種BALB/c裸小鼠，監(jiān)測(cè)各組荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)情況，觀察GM-CSF與IL-21單獨(dú)及聯(lián)合誘導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)。檢測(cè)荷瘤鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞數(shù)，ELISA法檢測(cè)血清IFN-γ和T

6、NF-α含量，MTT比色法測(cè)定裸鼠脾細(xì)胞NK殺傷活性，RT-PCR檢測(cè)各組裸鼠脾細(xì)胞中NKG2D分子的表達(dá)。 結(jié)果：SKOV3、SKoV3/Neo、SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL21和SKOV3/GM-CSF-IL21細(xì)胞的形態(tài)、增殖凋亡特性、細(xì)胞周期及HLA-ABC表達(dá)無(wú)明顯變化；SKOV3/GM-CSF細(xì)胞能使ICAM-1表達(dá)升高；SKOV3/IL21和SKOV3/GM-CSF-IL21細(xì)胞使MIC A/B和IC

7、AM-1表達(dá)顯著升高。與SKOV3及SKOV3/Neo相比，SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL21和 SKOV3/GM-CSF-IL21組攻擊的裸鼠體內(nèi)腫瘤形成受到明顯抑制，其中SKOV3/GM-CSF-1L21組更明顯，與其它各組比較均有顯著差異；sKOV3/GM-CSF-IL21攻擊組裸鼠的外周血白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)及1FN-γ和TNF-α含量均顯著升高，脾細(xì)胞NK殺傷活性及NKG2D表達(dá)均增強(qiáng)。 結(jié)