體內(nèi)表達法合成siRNA靶向神經(jīng)干細胞BACE1基因治療阿爾茨海默病的實驗研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimet's disease，AD)是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進行性退行性疾病，β淀粉樣蛋白(Amyloid β，Aβ)的沉積是AD病變的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)，對抗Aβ的形成、沉積及毒性作用是治療AD的根本策略。開發(fā)有效的針對Aβ代謝的關鍵酶--β-分泌酶(Beta-site App CleavingEnzyme，BACE1)的抑制劑是AD研究領域的新熱點。在AD患者或是動物模型腦內(nèi)，大量神經(jīng)元持續(xù)破壞的情況下，并

2、沒有大量神經(jīng)元再生，AD發(fā)生的過程可認為是內(nèi)源性神經(jīng)未能順利再生的過程?；蚬こ毯透杉毎浦驳难芯浚o生命科學帶來了重大的變革。機體使NSC進入細胞循環(huán)，并誘導其增殖、分化，產(chǎn)生各種神經(jīng)細胞替代缺損的細胞，是一種非常有潛力的修復神經(jīng)系統(tǒng)細胞損傷的手段。NSC具有Aβ?lián)p傷區(qū)的自主追蹤性，移植后的NSC能被特異性吸引到腦內(nèi)神經(jīng)退行性變區(qū)域；然而高濃度的Aβ對神經(jīng)干細胞卻有較強的抑制作用。因此，使AD患者腦部內(nèi)環(huán)境中的Aβ含量降低至一定水平對

3、于治療AD是及其必要的。隨著RNA干擾(RNA interfererice，RNAi)技術的發(fā)展和應用，獲得高純度、特異性的siRNA的方法從體外轉錄法發(fā)展到體內(nèi)表達法，本實驗利用體內(nèi)表達法下調(diào)神經(jīng)干細胞中：BACE1基因的表達量，使降低腦內(nèi)Aβ的濃度成為可能；鑒于神經(jīng)元難于轉染的特性，下調(diào)了BACE1基因的神經(jīng)干細胞也可用于誘導并分化為低表達BACE1基因的神經(jīng)元。這也就是本研究的目的與意義所在。 實驗目的： 在前期對AD

4、和RNA干擾研究的基礎之上，采用新的siRNA合成技術----體內(nèi)表達法，探討RNAi技術在神經(jīng)干細胞中特異性下調(diào)BACE1的效果，為利用RNAi技術靶向BACE1基因治療AD研究的進一步開展提供重要資料。 材料與方法： 1.構建能夠在細胞內(nèi)采用體內(nèi)表達生成siRNA的shRNA表達載體用于RNAi實驗。構建表達載體的基本步驟是：針對靶基因設計3條干擾片段，設計無關序列的對照作為陰性對照。合成相應的發(fā)夾狀插入DNA片段，并

5、將插入片段連接入pSilenCircle預切質(zhì)粒。該質(zhì)粒使用基于RNA的U6聚合酶Ⅲ啟動子和優(yōu)的終止子，從而在靶細胞內(nèi)啟動小RNA的轉錄。 2.以C17.2小鼠神經(jīng)干細胞系為實驗對象，將不同質(zhì)量外源GFP質(zhì)粒轉染進C17.2細胞，觀察質(zhì)粒質(zhì)量對細胞轉染率的影響。評價GFP質(zhì)粒單獨轉染時的劑量--轉染率關系，分析對于該細胞系最適合的轉染的質(zhì)粒質(zhì)量。 3.以C17.2小鼠神經(jīng)干細胞系為實驗對象，將3種重組干擾質(zhì)粒和pGFP-

6、C1質(zhì)粒共同轉染進C17.2細胞系。轉染后在熒光顯微鏡下觀察不同實驗組GFP的表達情況。于干擾后48h提取細胞總RNA，采用realtime-PCR檢測不同干擾位點BACE1 mRNA的表達水平。篩選出干擾效率最高的重組質(zhì)粒。 4.以C17.2小鼠神經(jīng)干細胞系為實驗對象，將篩選出最有效重組干擾質(zhì)粒轉染進C17.2細胞系。于干擾后3d、5d、7d提取細胞總RNA，采用realtime-PCR檢測BACE1 mRNA的表達水平。

7、 5.提取新生昆明種小鼠海馬部位神經(jīng)干細胞并培養(yǎng)鑒定。干擾其BACE1基因并于干擾后3d、5d、7d提取細胞總RNA，采用Realtime-PCR檢測BACE1 mRNA的表達水平。 結果： 1.構建了能夠在細胞內(nèi)產(chǎn)生有效靶向BACE1基因的siRNA的表達載體。 2.外源GFP質(zhì)粒可被成功轉染進C17.2細胞內(nèi)，并有效表達。熒光可在轉染后8小時或更早觀測到。通過實驗估算了使轉染效率最高的適宜的質(zhì)粒質(zhì)量。

8、 3.體內(nèi)表達法合成的siRNA有效的抑制了C17.2神經(jīng)干細胞系BACE1基因的表達。siRNA對BACE1的抑制效應與靶位點的選擇及干擾位點有關。干擾后選擇不同時間點進行檢測，干擾效果在較長時間內(nèi)可保持恒定。 4.成功提取了新生昆明種小鼠海馬部位的原代神經(jīng)干細胞并進行了鑒定。 5.體內(nèi)表達法合成的siRNA有效的抑制了原代神經(jīng)干細胞內(nèi)BACE1基因的表達，干擾效果亦可持續(xù)較長時間。 結論： 1．首

9、次自行設計合成了針對BACE1基因的RAN干擾片段，成功構建了RNA干擾質(zhì)粒重組體。該重組體可以利用體內(nèi)表達合成法合成siRNA，避免了目前多采用的體外轉錄、化學合成等方法對細胞毒性較大的弊端。重組體通過感受態(tài)菌體轉化等方法可大規(guī)模合成，為大范圍、高通量進行RNA干擾研究提供了一種理想的siRNA合成方法。 2．成功將表達型質(zhì)粒pEGFP-Cl利用脂質(zhì)體轉染入C17.2神經(jīng)干細胞系。該質(zhì)?？稍诩毎麅?nèi)表達外源性GFP基因。隨著pE

10、GFP-Cl質(zhì)粒轉染劑量的增加，轉染效率先升高后降低，提示轉染質(zhì)粒的劑量是保證轉染效率的必要條件。在C17.2細胞中轉染最佳劑量該質(zhì)粒后，轉染效率>90﹪，外源基因GFP表達持續(xù)時間>84小時，為使用RNA干擾質(zhì)粒重組體高效轉染C17.2神經(jīng)干細胞并在其內(nèi)持續(xù)表達靶向BACEl基因的siRNA提供了理論依據(jù)。 3．利用體內(nèi)表達法針對BACE1基因，將質(zhì)粒重組體和pEGFP-Cl質(zhì)粒共轉染C17.2神經(jīng)干細胞，成功抑制了其中內(nèi)源性

11、BACE1基因的表達，抑制作用呈現(xiàn)出位點效應和時間效應。通過檢測成功篩選出一條靈敏度高特異性強的靶向：BACE1基因的siRNA序列，其重組體干擾效果可達7天以上。提示RNA干擾后C17.2神經(jīng)干細胞可作為基因治療AD的理想的細胞株。 4．從新生昆明種小鼠海馬組織細胞中成功提取了原代神經(jīng)干細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)分裂增殖成由數(shù)百個細胞組成的神經(jīng)球。Nestin免疫熒光染色證實神經(jīng)干細胞純度高，GFAP和β-tublin免疫熒光染色證實神