bFGF轉(zhuǎn)染羊膜上皮細(xì)胞的建立及其對視神經(jīng)再生作用的初步研究.pdf

1、目的：視神經(jīng)損傷后雖然有神經(jīng)再生的潛力，但由于整個(gè)微環(huán)境不支持神經(jīng)再生，所以目前為止因視神經(jīng)損傷或疾病導(dǎo)致的失明還沒有較好的治療方法，而基因修飾細(xì)胞載體的研究可為視神經(jīng)再生提供新思路。因此，本研究從細(xì)胞移植的角度，建立用于基因修飾干細(xì)胞移植治療視神經(jīng)損傷的人bFGF基因修飾大鼠羊膜上皮細(xì)胞，并移植入大鼠視神經(jīng)損傷模型中，初步觀察和探討該細(xì)胞對視神經(jīng)修復(fù)的作用及相關(guān)機(jī)制。 方法：(1)取妊娠晚期SD大鼠的羊膜組織，貫序消化后進(jìn)行羊

2、膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，傳代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR鑒定。(2)構(gòu)建含人NGF分泌肽-bFGF編碼基因的慢病毒載體，經(jīng)測序鑒定后進(jìn)行慢病毒包裝，收獲病毒上清。(3)用病毒上清對傳代大鼠羊膜上皮細(xì)胞進(jìn)行感染并篩選，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR及ELISA法檢測基因轉(zhuǎn)染效果，體外培養(yǎng)觀察細(xì)胞生長活性。(4)用bFGF基因轉(zhuǎn)染羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清對PC12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以檢測所分泌bFGF多肽的生物學(xué)活性。(5)將基因轉(zhuǎn)染羊膜

3、上皮細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染羊膜上皮細(xì)胞移植入成年雄性SD大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型中，設(shè)以下4組：正常對照組；損傷組，于眼球后1.3mm處將微電極玻璃管刺入視神經(jīng)，完全吸除一段長約0.5 mm的神經(jīng)，致視神經(jīng)完全斷開，但保持視神經(jīng)外膜和血管完整，于視神經(jīng)缺損處注入10μl無血清培養(yǎng)基；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組是在損傷組的基礎(chǔ)上，于視神經(jīng)缺損處注入10μl未轉(zhuǎn)染羊膜上皮細(xì)胞懸液(8×106個(gè)/ml)；轉(zhuǎn)染細(xì)胞組是在損傷組的基礎(chǔ)上，于視神經(jīng)缺損處注入10μl轉(zhuǎn)染羊膜上

4、皮細(xì)胞懸液(8×106個(gè)/ml)。(6)在部分細(xì)胞移植組大鼠，制備移植細(xì)胞懸液前，用Hoechst33342對細(xì)胞進(jìn)行核標(biāo)記，術(shù)后14、28d經(jīng)心灌注固定，取視神經(jīng)冰凍切片，觀察標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量和分布。(7)部分動物取材前48h，玻璃體注射BDA標(biāo)記視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞，術(shù)后28d經(jīng)心灌注固定，取眼球視網(wǎng)膜鋪片，計(jì)數(shù)BDA標(biāo)記細(xì)胞。其余動物術(shù)后28d經(jīng)心灌注固定，取眼球視網(wǎng)膜鋪片，尼氏染色計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞；取視神經(jīng)眶內(nèi)段HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞

5、密度變化，免疫組織化學(xué)染色SABC法顯示GAP-43表達(dá)。 結(jié)果：(1)體外成功培養(yǎng)獲得大鼠羊膜上皮細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色及RT-PCR鑒定后顯示，除bFGF外，羊膜上皮細(xì)胞能表達(dá)上皮特異性標(biāo)志物CK-19、神經(jīng)類細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、GFAP以及細(xì)胞多能性標(biāo)志分子SSEA-4、Oct-4、Nanog、Sox2、Vimentin等。(2)成功構(gòu)建出含bFGF基因片段的慢病毒載體質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定與GeneBank收錄序列一

6、致。(3)成功進(jìn)行慢病毒包裝并收獲有較強(qiáng)感染能力的病毒上清。(4)完成對羊膜上皮細(xì)胞的感染并篩選得到能穩(wěn)定表達(dá)bFGF多肽的細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法染色和RT-PCR法檢測，可觀察到細(xì)胞內(nèi)有bFGF的表達(dá)，與轉(zhuǎn)染前的不表達(dá)有明顯區(qū)別；經(jīng)ELISA檢測顯示，轉(zhuǎn)染bFGF基因后的羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中有bFGF多肽的分泌，篩選后3天即可檢測到細(xì)胞培養(yǎng)上清中bFGF多肽的升高，6天后達(dá)到一個(gè)較高的水平并能維持穩(wěn)定分泌。(5)篩選后存活的轉(zhuǎn)染

7、細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增后，其細(xì)胞形態(tài)與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比無明顯差異，但其生長活性較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯提高。(6)用bFGF基因轉(zhuǎn)染羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清對PC12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后顯示，能明顯促進(jìn)PC12細(xì)胞的生長和分化，有突起細(xì)胞比例和細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組有明顯增加，說明分泌的bFGF多肽具有一定神經(jīng)營養(yǎng)活性。(7)將Hoechst33342核標(biāo)記細(xì)胞移植入大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型后，傷后14、28d取視神經(jīng)行冰凍切片，可觀察到損傷區(qū)有大量標(biāo)記的存活細(xì)胞，標(biāo)記

8、細(xì)胞能向受損視神經(jīng)近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段遷移并沿神經(jīng)外膜遷移，傷后28d標(biāo)記細(xì)胞有所減少。bFGF轉(zhuǎn)染羊膜上皮細(xì)胞可向近側(cè)段即眼球方向遷移至視神經(jīng)乳頭靠近視網(wǎng)膜處，向遠(yuǎn)側(cè)段可沿殘留的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞呈條索狀排列并遷移至約2mm遠(yuǎn)處。未轉(zhuǎn)染羊膜上皮細(xì)胞在傷區(qū)存活相對較少，遷移距離相對較短。損傷組損傷區(qū)未見核熒光的細(xì)胞。(8)損傷后28d，BDA標(biāo)記及尼氏染色視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，損傷組的節(jié)細(xì)胞密度較其他各組明顯降低；細(xì)胞移植組的節(jié)細(xì)胞密度較損傷

9、組明顯增加但仍低于正常組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的節(jié)細(xì)胞密度又顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。(9)HE染色視神經(jīng)顯示，損傷區(qū)有大量細(xì)胞存在，呈不規(guī)則條索狀分布并向兩端延伸。視神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)側(cè)段細(xì)胞細(xì)胞核明顯變小，而細(xì)胞移植組的胞核與正常對照組大小相似。傷后14、28d計(jì)數(shù)遠(yuǎn)側(cè)段細(xì)胞結(jié)果顯示，損傷組細(xì)胞數(shù)量與正常對照組相比有所降低；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的細(xì)胞數(shù)量較損傷組和正常組明顯增多，且轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的細(xì)胞數(shù)量顯著多于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組。(10)免疫組織化學(xué)法對視

10、神經(jīng)GAP-43染色后顯示，損傷組中GAP-43在損傷區(qū)僅有少量表達(dá)，遠(yuǎn)側(cè)段未見表達(dá)；細(xì)胞移植后損傷區(qū)GAP-43表達(dá)明顯增多，且轉(zhuǎn)染細(xì)胞組較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組增強(qiáng)。特別是在細(xì)胞移植組，少量GAP-43陽性、類似再生軸突樣結(jié)構(gòu)，由傷區(qū)伸入至遠(yuǎn)側(cè)段，且轉(zhuǎn)染細(xì)胞組深入更遠(yuǎn)，約0.3 mm。 結(jié)論：(1)所建立的人NGF分泌肽-bFGF轉(zhuǎn)染大鼠羊膜上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長活性及神經(jīng)營養(yǎng)活性；(2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植后，能在損傷的視神經(jīng)中大量存活并向