bFGF轉染羊膜上皮細胞的建立及其對視神經再生作用的初步研究.pdf

1、目的：視神經損傷后雖然有神經再生的潛力，但由于整個微環(huán)境不支持神經再生，所以目前為止因視神經損傷或疾病導致的失明還沒有較好的治療方法，而基因修飾細胞載體的研究可為視神經再生提供新思路。因此，本研究從細胞移植的角度，建立用于基因修飾干細胞移植治療視神經損傷的人bFGF基因修飾大鼠羊膜上皮細胞，并移植入大鼠視神經損傷模型中，初步觀察和探討該細胞對視神經修復的作用及相關機制。 方法：(1)取妊娠晚期SD大鼠的羊膜組織，貫序消化后進行羊

2、膜上皮細胞原代培養(yǎng)，傳代細胞進行免疫熒光細胞化學和RT-PCR鑒定。(2)構建含人NGF分泌肽-bFGF編碼基因的慢病毒載體，經測序鑒定后進行慢病毒包裝，收獲病毒上清。(3)用病毒上清對傳代大鼠羊膜上皮細胞進行感染并篩選，經免疫熒光細胞化學、RT-PCR及ELISA法檢測基因轉染效果，體外培養(yǎng)觀察細胞生長活性。(4)用bFGF基因轉染羊膜上皮細胞的培養(yǎng)上清對PC12細胞進行培養(yǎng)，以檢測所分泌bFGF多肽的生物學活性。(5)將基因轉染羊膜

3、上皮細胞及未轉染羊膜上皮細胞移植入成年雄性SD大鼠視神經吸斷傷模型中，設以下4組：正常對照組；損傷組，于眼球后1.3mm處將微電極玻璃管刺入視神經，完全吸除一段長約0.5 mm的神經，致視神經完全斷開，但保持視神經外膜和血管完整，于視神經缺損處注入10μl無血清培養(yǎng)基；未轉染細胞組是在損傷組的基礎上，于視神經缺損處注入10μl未轉染羊膜上皮細胞懸液(8×106個/ml)；轉染細胞組是在損傷組的基礎上，于視神經缺損處注入10μl轉染羊膜上

4、皮細胞懸液(8×106個/ml)。(6)在部分細胞移植組大鼠，制備移植細胞懸液前，用Hoechst33342對細胞進行核標記，術后14、28d經心灌注固定，取視神經冰凍切片，觀察標記細胞的數(shù)量和分布。(7)部分動物取材前48h，玻璃體注射BDA標記視網膜節(jié)細胞，術后28d經心灌注固定，取眼球視網膜鋪片，計數(shù)BDA標記細胞。其余動物術后28d經心灌注固定，取眼球視網膜鋪片，尼氏染色計數(shù)視網膜節(jié)細胞；取視神經眶內段HE染色觀察組織結構和細胞

5、密度變化，免疫組織化學染色SABC法顯示GAP-43表達。 結果：(1)體外成功培養(yǎng)獲得大鼠羊膜上皮細胞，經免疫熒光細胞化學染色及RT-PCR鑒定后顯示，除bFGF外，羊膜上皮細胞能表達上皮特異性標志物CK-19、神經類細胞標志物Nestin、GFAP以及細胞多能性標志分子SSEA-4、Oct-4、Nanog、Sox2、Vimentin等。(2)成功構建出含bFGF基因片段的慢病毒載體質粒，經測序鑒定與GeneBank收錄序列一

6、致。(3)成功進行慢病毒包裝并收獲有較強感染能力的病毒上清。(4)完成對羊膜上皮細胞的感染并篩選得到能穩(wěn)定表達bFGF多肽的細胞，經免疫熒光細胞化學法染色和RT-PCR法檢測，可觀察到細胞內有bFGF的表達，與轉染前的不表達有明顯區(qū)別；經ELISA檢測顯示，轉染bFGF基因后的羊膜上皮細胞培養(yǎng)上清中有bFGF多肽的分泌，篩選后3天即可檢測到細胞培養(yǎng)上清中bFGF多肽的升高，6天后達到一個較高的水平并能維持穩(wěn)定分泌。(5)篩選后存活的轉染

7、細胞經擴增后，其細胞形態(tài)與未轉染的細胞相比無明顯差異，但其生長活性較未轉染細胞明顯提高。(6)用bFGF基因轉染羊膜上皮細胞的培養(yǎng)上清對PC12細胞進行培養(yǎng)后顯示，能明顯促進PC12細胞的生長和分化，有突起細胞比例和細胞數(shù)較未轉染細胞組有明顯增加，說明分泌的bFGF多肽具有一定神經營養(yǎng)活性。(7)將Hoechst33342核標記細胞移植入大鼠視神經吸斷傷模型后，傷后14、28d取視神經行冰凍切片，可觀察到損傷區(qū)有大量標記的存活細胞，標記

8、細胞能向受損視神經近側段和遠側段遷移并沿神經外膜遷移，傷后28d標記細胞有所減少。bFGF轉染羊膜上皮細胞可向近側段即眼球方向遷移至視神經乳頭靠近視網膜處，向遠側段可沿殘留的神經膠質細胞呈條索狀排列并遷移至約2mm遠處。未轉染羊膜上皮細胞在傷區(qū)存活相對較少，遷移距離相對較短。損傷組損傷區(qū)未見核熒光的細胞。(8)損傷后28d，BDA標記及尼氏染色視網膜節(jié)細胞的計數(shù)結果顯示，損傷組的節(jié)細胞密度較其他各組明顯降低；細胞移植組的節(jié)細胞密度較損傷

9、組明顯增加但仍低于正常組，轉染細胞組的節(jié)細胞密度又顯著高于未轉染細胞組。(9)HE染色視神經顯示，損傷區(qū)有大量細胞存在，呈不規(guī)則條索狀分布并向兩端延伸。視神經損傷后遠側段細胞細胞核明顯變小，而細胞移植組的胞核與正常對照組大小相似。傷后14、28d計數(shù)遠側段細胞結果顯示，損傷組細胞數(shù)量與正常對照組相比有所降低；未轉染細胞組和轉染細胞組的細胞數(shù)量較損傷組和正常組明顯增多，且轉染細胞組的細胞數(shù)量顯著多于未轉染細胞組。(10)免疫組織化學法對視

10、神經GAP-43染色后顯示，損傷組中GAP-43在損傷區(qū)僅有少量表達，遠側段未見表達；細胞移植后損傷區(qū)GAP-43表達明顯增多，且轉染細胞組較未轉染細胞組增強。特別是在細胞移植組，少量GAP-43陽性、類似再生軸突樣結構，由傷區(qū)伸入至遠側段，且轉染細胞組深入更遠，約0.3 mm。 結論：(1)所建立的人NGF分泌肽-bFGF轉染大鼠羊膜上皮細胞具有較強的生長活性及神經營養(yǎng)活性；(2)轉染細胞移植后，能在損傷的視神經中大量存活并向