微環(huán)境中腫瘤相關成纖維細胞介導的清熱化濕中藥抗胰腺癌作用研究.pdf

1、目的：
　　探討清熱化濕中藥（清胰化積方，QYHJ）抗胰腺癌過程中腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)的作用。
　　方法：
　　第一部分，
　　1.建立胰腺癌皮下移植瘤模型，分成QYHJ組和生理鹽水對照組，評價QYHJ對胰腺癌生長的影響。
　　2.建立胰腺癌原位移植瘤模型，分成QYHJ組和生理鹽水對照組，評價QYHJ對胰腺癌肝轉移的影響。
　　第二部分，
　　1.家兔胃飼QYHJ獲取含中藥血清，并取正

2、常家兔血清為對照組。56℃水浴鍋，30分鐘，制備滅活的中藥血清及正常血清。
　　2.CCK-8法測定正常血清、正常滅活血清、中藥血清、中藥滅活血清對人胰腺癌細胞體外增殖的影響，并繪制細胞增殖曲線。
　　3.體外遷移及侵襲實驗(Transwell)檢測正常血清、正常滅活血清、中藥血清、中藥滅活血清對人胰腺癌細胞體外遷移及侵襲能力的影響。
　　第三部分，
　　1.采用原代培養(yǎng)的方法建立兩對人胰腺正常成纖維細胞(NFs

3、)及對應的腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)。
　　2.采用免疫熒光(ICC)及Western-blot對原代培養(yǎng)成的成纖維細胞進行鑒定。
　　3.采用RT-PCR、Western-blot技術檢測NFs、CAFs及經(jīng)含藥血清處理的CAFs之間CXCL1、2、8表達的差異。
　　4.CCK-8法測定含中藥血清對CAFs體外增殖的影響。
　　5.采用免疫組化技術評價QYHJ干預后CAFs在小鼠移植瘤中增殖能力的變化。<

4、br>　　6.采用免疫組化及Elisa技術評價CAFs表達、分泌CXCL1、2、8能力的改變。
　　第四部分，
　　1.體外遷移及侵襲實驗(Transwell)檢測CXCL1、2、8對人胰腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響。
　　2.體外成球實驗檢測CXCL8/CXCR1對人胰腺癌細胞干性的影響。
　　3.流式細胞技術檢測CXCL8/CXCR1對人胰腺癌干細胞比例的影響。
　　4.免疫組化法檢測人體組織中CXCR

5、1與干細胞標記物CD24/44/133的表達水平。
　　5.統(tǒng)計分析CXCR1及CD24/44/133之間表達水平的相關性。
　　6.統(tǒng)計臨床資料分析CXCR1表達水平與胰腺癌患者臨床特征之間的相關性。
　　7.單因素及多因素分析CXCR1表達水平與胰腺癌患者預后的關系。
　　第五部分，
　　體外遷移及侵襲實驗(Transwell)檢測NFs、CAFs及經(jīng)含中藥血清處理的CAFs上清對人胰腺癌細胞遷移及侵襲

6、能力的影響。
　　結果：
　　第一部分，
　　在皮下移植瘤實驗中，QYHJ組和Control組的成瘤率均達到100％。但Control組與QYHJ組之間腫瘤生長速度存在差異，中藥組經(jīng)過QYHJ干預后腫瘤的生長速度低于Control組，從QYHJ干預第15天開始兩組之間腫瘤的生長速度就出現(xiàn)了明顯差異(P＜0.05)。第21天處死裸鼠，發(fā)現(xiàn)QYHJ組平均瘤重小于Control組，Control組和QYHJ組的瘤重分別為0.

7、705±0.198809g、0.435429±0.151751g，抑瘤率為38.24％(P＜0.05)。在原位移植瘤實驗中，QYHJ組原位移植瘤的體積明顯小于對照組，并且QYHJ組小鼠肝臟轉移灶的數(shù)目(P=0.042)及轉移率(P=0.002)也明顯少于對照組。提示QYHJ可以有效地抑制胰腺癌的增殖及轉移。
　　第二部分，
　　四組血清對人胰腺癌細胞系增殖、遷移及侵襲的抑制能力有顯著差異，從高到低分別為中藥組、正常、中藥滅活

8、組、正常滅活組。正常組高于正常滅活組，這可能和機體在正常情況下的免疫反應有關。中藥滅活組高于正常滅活組，這可能和中藥有效成分本身對于胰腺癌細胞的直接作用有關。中藥組高于中藥滅活組，提示中藥抗胰腺癌存在間接作用，且這部分間接作用能夠有效地抑制胰腺癌的惡性潛能。
　　第三部分，
　　經(jīng)過原代培養(yǎng)建立起兩對（＃1，＃2）相應的NFs和CAFs細胞，并選取上皮細胞標記物人廣譜細胞角蛋白(Pan Cytokeration[AE1/AE

9、3]，CK)、E-cadherin，間質(zhì)標記物Vimentin及CAFs特異性標記物α-SMA，通過免疫熒光(ICC)和Western-blot的方法對其進行鑒定。結果顯示NFs和CAFs都不表達上皮細胞標記物CK及E-cadherin，但都表達間質(zhì)標記物Vimentin，CAFs還高表達其特異指標α-SMA。提示我們成功建立起人胰腺NFs及胰腺癌CAFs。
　　我們進一步檢測了成纖維細胞分泌的CXCL家族的幾個因子的表達。結果顯

10、示CXCL1、2、8在CAFs中的表達明顯高于NFs，且在用QYHJ干預后CAFs中的CXCL1、2、8表達明顯下調(diào)。體內(nèi)免疫組化的結果也提示QYHJ組中CXCL1、2、8的陽性率明顯降低，進一步檢測小鼠血清中CXCLs的含量，發(fā)現(xiàn)它們在Control和QYHJ組中含量分別為57.49±5.07pg/L VS43.27±7.01pg/L(P＜0.05);42.88±4.00 pg/L VS33.92±1.42pg/L(P＜0.05);3

11、43.03±50.68 pg/L VS190.52±39.36 pg/L(P＜0.05)。同時我們也觀察了QYHJ對CAFs增殖的影響，體外增殖實驗中QYHJ組OD值明顯低于Control組，體內(nèi)的免疫組化結果提示QYHJ干預后Vimentin和α-SMA表達明顯下降，提示QYHJ能抑制CAFs的增殖。
　　第四部分，
　　在遷移和侵襲實驗當中CXCL1、2、8干預組中Capan1細胞的穿過數(shù)量都高于對照組和抑制劑組(P＜0

12、.05)。成球實驗中CXCL8組中干細胞球的數(shù)量明顯多于對照組(P=0.000)，在加入抑制劑后CXCL8誘導的干細胞成球能力受到抑制(P=0.002)。在CXCL8誘導后Capan1干細胞比例明顯高于對照組(P=0.002)和抑制劑組(P=0.03)。
　　臨床資料的分析結果顯示CXCR1和胰腺癌干細胞標記物CD44/133表達呈正相關，并且和胰腺癌淋巴結轉移關系密切。同時CXCR1、CD44/133也和胰腺癌患者的預后相關，C

13、XCR1是胰腺癌患者預后的一個獨立相關因素。
　　第五部分，
　　NFs組及QYHJ干預后的CAFs條件培養(yǎng)基組比CAFs條件培養(yǎng)基組Capan1細胞穿透數(shù)量更少(P＜0.05)。
　　結論：
　　QYHJ可以有效地抑制胰腺癌細胞的增殖及遠處轉移，它的這種作用除了本身有效成分之外，還存在間接作用，其中的一個間接靶點在于CAFs。QYHJ可以通過抑制CAFs的增殖以及抑制CAFs分泌CXCL1、2、8間接地達到抗胰