成纖維細(xì)胞活化蛋白FAP對(duì)小鼠胰腺癌細(xì)胞的影響及治療研究.pdf

1、目的：構(gòu)建小鼠成纖維細(xì)胞活化蛋白FAP的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染體外真核細(xì)胞系及免疫注射C57BL/6小鼠，綜合評(píng)價(jià)該真核表達(dá)質(zhì)粒在體外及體內(nèi)表達(dá)的工作效率，并驗(yàn)證該重組表達(dá)載體作為核酸疫苗對(duì)于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的殺傷效果以及對(duì)荷瘤小鼠胰腺癌腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，從而為胰腺癌的預(yù)防和治療提供一個(gè)新的手段和思路。
　　方法：根據(jù)GenBank中小鼠FAP基因(NM_007986)全序列設(shè)計(jì)PCR引物，利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得其開放式閱

2、讀框(ORF)。將目的基因片段克隆至真核表達(dá)載體pcDNA6/myc-His-B，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌并篩選重組子。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞系，利用免疫熒光染色法(IF)及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)檢測(cè)外源性FAP蛋白是否能夠在細(xì)胞中順利表達(dá)。之后，通過分離并培養(yǎng)原代小鼠胰腺癌細(xì)胞及腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，利用小干擾分子RNA(siRNA)靶向沉默其內(nèi)源性FAP蛋白的表達(dá)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTQ

3、-PCR)、Western Blotting實(shí)驗(yàn)及免疫熒光(IF)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)其靶向沉默的效果；同時(shí)利用噻唑藍(lán)染色法(MTT)和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)來檢測(cè)當(dāng)內(nèi)源性FAP蛋白表達(dá)下調(diào)后，“原代胰腺癌-腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞”共培養(yǎng)體系中，兩種細(xì)胞的增殖和凋亡情況，明確FAP對(duì)于胰腺癌細(xì)胞及胰腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞增殖和生長的抑制作用。利用FAP真核表達(dá)質(zhì)粒免疫C57BL/6小鼠，通過免疫組織化學(xué)(ICH)及RTQ-PCR方法檢測(cè)其在小鼠體內(nèi)的表達(dá)情

4、況。最后，將小鼠胰腺癌細(xì)胞接種于小鼠皮下，分組：FAP免疫組、空白質(zhì)粒免疫組和生理鹽水對(duì)照組。而后監(jiān)測(cè)瘤體體積、小鼠生命周期及瘤體組織中波形蛋白Vimentin(成纖維細(xì)胞標(biāo)志)、角蛋白CK8(上皮細(xì)胞標(biāo)志)及FAP的表達(dá)，來衡量FAP作為核酸疫苗是否可以預(yù)防和控制胰腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，延長荷瘤小鼠的生存周期。
　　結(jié)果：對(duì)于小鼠FAP的真核載體，經(jīng)過酶切鑒定、測(cè)序比對(duì)，確定所篩選的陽性克隆為pcDNA6-mFAP重組子，其

5、可在真核細(xì)胞HEK293中正常表達(dá)，并產(chǎn)生相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。免疫熒光染色結(jié)果也表明，在轉(zhuǎn)染pcDNA6-mFAP重組子的細(xì)胞中，其表現(xiàn)出明顯的紅色熒光(anti-Myc-CY3)和綠色熒光(anti-FAP-FITC)，證實(shí)在其表面有FAP蛋白的表達(dá)；而對(duì)于空白質(zhì)粒組和無轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞均無上述熒光表達(dá)。另外，Western Blotting結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA6-mFAP重組子的細(xì)胞總蛋白中，有抗FAP的條帶與抗Myc的條帶，而其他兩

6、組細(xì)胞均無此條帶產(chǎn)生，故所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，所構(gòu)建的pcDNA6-mFAP重組子可以在體外培養(yǎng)的真核細(xì)胞中順利表達(dá)外源性FAP蛋白。隨后，本實(shí)驗(yàn)成功分離小鼠原代胰腺癌細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，并且建立了兩者共培養(yǎng)體系模型。HE染色可見共培養(yǎng)體系模型中的胰腺癌細(xì)胞及腫瘤成纖維細(xì)胞共同生長。RTQ-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了siRNA-FAP的共培養(yǎng)體系模型中，F(xiàn)AP蛋白的mRNA表達(dá)量(0.52±0.02，n=3)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)染siRNA-MO

7、CK的共培養(yǎng)體系模型(0.99+0.07，n=3，P<0.05，t test)及未轉(zhuǎn)染任何分子的空白對(duì)照組共培養(yǎng)體系模型(1.01±0.10，n=3，P<0.05，ttest)，該結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同樣Western Blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染了siRNA-FAP的共培養(yǎng)體系模型中，F(xiàn)AP蛋白的表達(dá)量(27.18％±3.23％)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)染siRNA-MOCK的共培養(yǎng)體系模型(61.58％±4.72％，P=0.0317

8、，t test)及未轉(zhuǎn)染任何分子的空白對(duì)照組共培養(yǎng)體系模型(65.29％±4.78％，P=0.0389，ttest)，該結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的siRNA可以成功下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性FAP的表達(dá)。此后MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-FAP轉(zhuǎn)染組胰腺癌細(xì)胞的生長速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染siRNA-MOCK的細(xì)胞組；而胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制率從轉(zhuǎn)染后第二天起即明顯高于另外兩組數(shù)據(jù)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，

9、且該增殖抑制率隨時(shí)間的增長呈現(xiàn)負(fù)增長趨勢(shì)，至第七天達(dá)峰值。另外，F(xiàn)CM結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)染了siRNA-FAP的細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象(42.31％±5.34％)，其與未轉(zhuǎn)染組相比(7.02％±2.11％)，具有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AP蛋白的表達(dá)下調(diào)會(huì)顯著抑制小鼠胰腺癌細(xì)胞及腫瘤成纖維細(xì)胞的增殖和生長，并引起細(xì)胞的凋亡。最后，我們對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行FAP免疫，免疫熒光檢測(cè)和RTQ-PCR結(jié)果都提

10、示，注射了FAP真核表達(dá)質(zhì)粒的小鼠，其組織中均有FAP的高表達(dá)，而空白質(zhì)粒組和生理鹽水組中未見相應(yīng)蛋白表達(dá)。同時(shí)，通過對(duì)不同分組小鼠注射相應(yīng)質(zhì)粒后進(jìn)行腫瘤細(xì)胞接種，進(jìn)行免疫組化測(cè)定并計(jì)算其生存周期和瘤體體積測(cè)量。免疫組化結(jié)果顯示：經(jīng)FAP真核質(zhì)粒免疫后的小鼠，其腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞表面FAP蛋白的表達(dá)明顯減弱，與生理鹽水對(duì)照組相比，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，腫瘤上皮細(xì)胞標(biāo)志CK8和成纖維細(xì)胞標(biāo)志Vemetin的表達(dá)，也明顯低于生理鹽水對(duì)

11、照組，具有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，注射空白質(zhì)粒免疫組的小鼠，其腫瘤上的FAP、CK8及Vemetin三個(gè)蛋白的表達(dá)與生理鹽水組相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。腫瘤體積測(cè)量結(jié)果表明，經(jīng)FAP核酸免疫過的小鼠，其成瘤的速率顯著慢于未注射FAP核酸疫苗的對(duì)照組：而且，在4周內(nèi)，F(xiàn)AP免疫組小鼠的腫瘤生長緩慢，腫瘤體積((長徑×短徑2)/2)增長不明顯，其與注射生理鹽水空白對(duì)照組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)于注射生理鹽水空白對(duì)照組和空白質(zhì)粒免疫組的

12、老鼠，腫瘤生長迅速，而該兩組的腫瘤體積之比不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。生存周期結(jié)果表明，經(jīng)FAP免疫后的小鼠，生存率普遍提高，且第1、第2周均無死亡，第4周的存活數(shù)為6只。而生理鹽水對(duì)照組和空白質(zhì)粒免疫組的小鼠，至第2周開始陸續(xù)死亡，死亡的數(shù)量均大于FAP免疫組的小鼠，當(dāng)?shù)降?周時(shí)，生理鹽水組和空白質(zhì)粒組的存活數(shù)分別只有3只和5只，均少于FAP免疫組。
　　結(jié)論：利用基因工程構(gòu)建的FAP真核表達(dá)質(zhì)?？梢皂樌隗w外培養(yǎng)的真核細(xì)胞中，及小鼠體內(nèi)