結(jié)核性腦膜炎的潛在體液生物標志物研究.pdf

1、結(jié)核性腦膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，約占結(jié)核病的7～10％，是以腦膜、大腦實質(zhì)受損為主，并可波及脊髓、脊膜的非化膿性炎癥。近年來由于人口流動頻繁、免疫抑制劑廣泛應用、耐藥性結(jié)核菌株的出現(xiàn)及人免疫缺陷病毒的流行，TBM發(fā)病率有逐漸增高的趨勢。而TBM的防治和診療過程中，早期準確的診斷與預后和治療效果

2、緊密相關(guān)聯(lián)，因此準確有效的診斷方法在防治TBM中仍是當今亟待解決的重要醫(yī)學問題。
　　當前TBM的診斷主要依靠腦脊液(CSF)細胞、生化等檢查。然而在TBM發(fā)生早期，CSF細胞學、生化變化多不典型，早期TBM診斷十分困難。本實驗擬采用iTRAQ標記結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(iTRAQ—LC—MS/MS)的定量蛋白組學研究策略，比較TBM患者和健康對照CSF蛋白質(zhì)表型，鑒定出TBM相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，為探討TBM病理生理機制和篩選潛在診斷

3、標志物提供新的證據(jù)。
　　TBM常伴有血腦屏障的破壞，這使得TBM相關(guān)的代謝分子極易從CSF擴散至外周血液，提示檢測TBM血液的代謝改變有望發(fā)現(xiàn)其潛在診斷標志物。本實驗擬采用核磁共振(NMR)的代謝組學方法，篩選出TBM的潛在血液診斷標志物。
　　目的:
　　1.采用iTRAQ的定量蛋白組學技術(shù)，分析TBM和正常的腦脊液蛋白質(zhì)改變、篩選并驗證TBM的潛在CSF診斷蛋白質(zhì)標志物;
　　2.采用核磁共振(NMR)的代

4、謝組學方法，比較結(jié)核性腦膜炎患者與正常對照的血漿代謝譜，篩選TBM的潛在血漿代謝診斷標志物。
　　方法:
　　1.第一部分:通過iTRAQ標記蛋白組學方法，比較TBM疾病組(n=12)和正常對照(n=12)腦脊液蛋白譜，多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定TBM相關(guān)的腦脊液差異蛋白，通過生物信息學分析對差異蛋白進行功能注釋和通路分析。進一步將篩選出的潛在的生物標志物蛋白進行WB驗證，并構(gòu)建診斷模型進行診斷效能評估。

5、
　　2.第二部分:采用核磁共振(NMR)的代謝組學方法，比較結(jié)核性腦膜炎患者與正常對照的血漿代謝譜，篩選出結(jié)核性腦膜炎患者相對于健康對照者的血漿差異代謝物;分析差異代謝物的分子功能，初步探討這些血漿差異代謝物在結(jié)核性腦膜炎發(fā)病中的潛在作用。
　　結(jié)果:
　　1.使用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒別出81例差異蛋白質(zhì)，對這部分蛋白質(zhì)進行生物信息學分析，結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)的功能主要與凝血級聯(lián)反應，炎癥反應，細胞粘附密切相

6、關(guān)。WB蛋白印跡實驗驗證結(jié)果指出NELL2水平在TBM疾病組相對于健康對照組呈現(xiàn)顯著下降。ROC曲線分析結(jié)果提示NELL2的診斷效能:83.3％的敏感性和75％的特異性。該結(jié)果提示NELL2是TBM具有良好診斷效能的潛在生物標志物。
　　2.采用核磁共振(NMR)偶聯(lián)OPLS-DA的統(tǒng)計方法鑒定出TBM血漿相對于正常對照中的差異代謝物如下:有24個血漿差異代謝物質(zhì)在結(jié)核性腦膜炎組與正常組區(qū)分中起主要作用(VIP＞1.0)。N-乙酰

7、糖蛋白(N-acetylglycoprotein)、丙酮酸鹽(Pyruvate)、葡萄糖(Glucose)、煙酰胺(Nicotinamide)、1-甲基組氨酸（1-Methylhistidine）、葡萄糖-內(nèi)酯(Glucono-delta-lactone)在結(jié)核性腦膜炎中的表達量增高;低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白（VLDL）、脂質(zhì)(Lipid)、異亮氨酸(Isoleucine)、亮氨酸(Leucine)、纈氨酸(Valine)

8、、谷氨酸(Glutamine)、蛋氨酸(Methoinine)、組氨酸(Histidine)、3-羥基丁酸酯（3-Hydroxybutyrate）、乙酸(Acetate)、丙酮(Acetone)、乙醇(Ethanol)、磷酸膽堿(PC)、甘油磷酸膽堿(GPC)、乙酰乙酸(Acetoacetate)、谷氨酰胺(Glutamate)、N-甲基煙酰胺(N-Methylnicotinamide)在結(jié)核性腦膜炎中的表達量降低。四種生物標志物N-乙

9、酰糖蛋白(N-acetylglycoprotein)、煙酰胺(Nicotinamide)、葡萄糖(α-Glucose，β-Glucose)經(jīng)二元Logistical Regression分析，在訓練集中可區(qū)分結(jié)核性腦膜炎患者與正常對照，AUC值為0.810。在測試集中，這四種生物標志物可區(qū)分12例結(jié)核性腦膜炎患者與13例正常對照，AUC值為0.827。在病毒性腦膜炎與結(jié)核性腦膜炎訓練集中，這四種生物標志物的AUC值為0.782。