GRB10-CDK5RAP3在HEK293T細(xì)胞中與Apoptin蛋白相互作用的研究.pdf

1、Apoptin/VP3(凋亡素)是一種來源于雞貧血病毒(CAV)的小分子蛋白,由121個氨基酸構(gòu)成,其能通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡,對正常細(xì)胞沒有毒副作用,其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞選擇性凋亡并不依賴p53途徑,不受抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的調(diào)節(jié),但其作用機制尚未完全闡明。
　　前期實驗室課題組以His-Apoptin融合蛋白誘餌,通過pull-down技術(shù)獲得可能與Apoptin相互作用蛋白多種,包括 HSPA9,G

2、RB10,GRB14,CDK5RAP3,TNFAIP1等。其中HSPA9已經(jīng)被驗證其在HepG2細(xì)胞中能與Apoptin蛋白發(fā)生其相互作用關(guān)系,并影響其特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡效應(yīng)。
　　目的：
　　通過研究GRB10/CDK5RAP3與Apoptin在HEK293T細(xì)胞中的相互作用,為Apoptin相關(guān)蛋白研究提供可能的線索,從而為Apoptin的選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制研究提供可能的目標(biāo)蛋白。
　　方法：

3、　　通過分子克隆技術(shù),構(gòu)建帶有-HIS標(biāo)簽的GRB10和CDK5RAP3的真核表達(dá)載體,經(jīng)酶切、測序鑒定后,將其與已經(jīng)構(gòu)建好的HA-Apoptin質(zhì)粒通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞,然后提取細(xì)胞蛋白,通過免疫共沉淀技術(shù),免疫印跡技術(shù),檢測GRB10/CDK5RAP3是否與Apoptin在HEK293T細(xì)胞中發(fā)生相互作用。
　　結(jié)果：
　　我們成功構(gòu)建了帶-HIS標(biāo)簽的GRB10和CDK5RAP3真核表達(dá)載體。并將其單獨

4、轉(zhuǎn)染和其與Apoptin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于 HEK293T細(xì)胞中均獲得了表達(dá)。共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,蛋白進(jìn)行免疫共沉淀和免疫印跡,結(jié)果表明,在HEK293T細(xì)胞中GRB10和Apoptin蛋白可能不存在直接的相互作用。在HEK293T細(xì)胞中同樣也未觀察到CDK5RAP3和Apoptin的相互作用。
　　結(jié)論：
　　1.在HEK293T細(xì)胞中,GRB10與Apoptin可能不存在直接的相互作用。
　　2.在HEK293T細(xì)胞中,CDK