HEK293T細(xì)胞中siRNA干擾沉默Apc11對(duì)細(xì)胞周期的影響及APC11L與NKD2的蛋白相互作用與功能研究.pdf

1、APC復(fù)合體(促后期復(fù)合物， Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome)參與了很多細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的泛素化作用。它參與的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)的功能失調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖紊亂、基因組不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生。
　　APC11是APC復(fù)合體中具有泛素連接酶E3催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，本論文包括兩部分，第一部分是關(guān)于siRNA干擾沉默Apc11對(duì)于細(xì)胞功能影響以及APC11L功能的初步研究;第二部分是關(guān)于APC11L和NK

2、D2的相互作用及其功能的研究。
　　在論文的第一部分，我們通過比對(duì)分析現(xiàn)在已知的人類APC11的7個(gè)mRNA剪切本，發(fā)現(xiàn)這7個(gè)剪切本可以編碼2種蛋白質(zhì)，并且根據(jù)長(zhǎng)度不同，我們分別命名為APC11S和APC11L。我們?cè)贑DS區(qū)和3UTR各設(shè)計(jì)了2條干擾序列，可以干擾抑制Apc11，RT-PCR鑒定得到2條有效地干擾序列，干擾的程度分別是50％和80％，在HEK293T中，對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)siRNA干擾沉默促進(jìn)了細(xì)

3、胞的增殖。在干擾同時(shí)通過外源分別轉(zhuǎn)染APC11L、APC11S，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種蛋白質(zhì)都可以一定程度挽救siRNA干擾引起的促生長(zhǎng)的效應(yīng)，表明APC11L可能在細(xì)胞周期中也發(fā)揮一定的作用。
　　我們通過GST-PULLDOWN實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):APC11L與APC11S都可以與APC復(fù)合體的APC2結(jié)合，表明二者可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合APC2。亞細(xì)胞定位的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)APC11L和APC11S的分布相似，都在細(xì)胞間期彌散分布于核周的細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞分裂

4、過程中的染色質(zhì)上和細(xì)胞質(zhì)中也檢測(cè)到APC11L。細(xì)胞轉(zhuǎn)染過量表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在Nocodazole同步化的HEK293T細(xì)胞中，APC11L促進(jìn)CCNB1的降解，抑制AURORA-A的降解。
　　通過熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)了APC11L對(duì)于不同信號(hào)通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APC11L對(duì)于個(gè)信號(hào)通路都只有微弱的影響，AP1、AP1-PMA、CRE、GRE、HRE、WNT和C-MYC等促進(jìn)細(xì)胞增殖的通路呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，并且一定程度的激活了E2F、

5、NFAT、NF-kappaB、p53和RB通路。
　　由于APC11L擁有與APC復(fù)合體的核心催化亞基APC11S的N末端序列，可以挽救siRNA干擾沉默Apc11的效應(yīng)，并且可以影響CCNB1和AURORA-A的降解。因此本文發(fā)現(xiàn)APC11L對(duì)于促進(jìn)增殖的各個(gè)信號(hào)通路有比較小的下調(diào)作用，為深入研究APC11L的功能及其對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制提供了新的線索。
　　在論文的第二部分，我們用酵母雙雜交的方法以APC11L為誘餌篩選

6、人肝cDNA文庫(kù)，首次得到了一個(gè)新的相互作用蛋白NKD2，并通過GST-Pulldown和細(xì)胞免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)分別在體外和體內(nèi)驗(yàn)證了這種相互作用的特異性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了兩者之間相互作用的鋅離子依賴性。我們進(jìn)一步在Hela細(xì)胞中證實(shí)這兩種蛋白質(zhì)在分裂間期和分裂期都可以共定位在一起。通過測(cè)定Hela細(xì)胞的NKD2穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞的細(xì)胞周期，我們還發(fā)現(xiàn)NKD2可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，而且這種抑制是通過延緩細(xì)胞周期中M/G1的進(jìn)程速度實(shí)現(xiàn)的，NKD2可以抵消