表達(dá)HCV NS3蛋白肝細(xì)胞中ERK與NF-κB、JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的cross-talk研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，流行病學(xué)研究顯示肝炎病毒感染、黃曲霉毒素的攝入及酗酒是其重要的致病因素。分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的深入研究，對(duì)HCC發(fā)生機(jī)制的闡明起到了重要的推動(dòng)作用。丙型肝炎病毒(hepatitis virus C,HCV)是HCC的重要致病因子之一，持續(xù)的感染可導(dǎo)致慢性丙型肝炎，并可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌，其致癌機(jī)制尚不清楚。據(jù)統(tǒng)計(jì)，

2、目前全世界約有1.5億人口感染丙型肝炎病毒。 HCV是一種正鏈RNA病毒，無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶活性，只能在細(xì)胞胞漿內(nèi)復(fù)制，不能與宿主基因整合，主要是通過(guò)其表達(dá)的蛋白質(zhì)作用于宿主細(xì)胞發(fā)揮其致癌效用，其中HCVNS3、NS5和核心蛋白與HCC的發(fā)生關(guān)系尤為密切。 HCV NS3蛋白是含631個(gè)氨基酸(1026—1656)的胞漿蛋白。HCV NS3蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MH／3T3細(xì)胞后，細(xì)胞端粒酶活性顯著增高；本實(shí)驗(yàn)小組前期研究證實(shí)HCV

3、 NS3蛋白N端多肽可以誘導(dǎo)QSG7701細(xì)胞株轉(zhuǎn)化，并接種裸鼠成瘤。這些結(jié)果均提示HCV NS3蛋白是HCV相關(guān)性HCC發(fā)生的重要因子。 腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段發(fā)展的過(guò)程，涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多方面。尤其是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與疾病關(guān)系已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和前沿，故本研究擬探討細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)通路在HCV NS3蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制，ERK 通路與NF-r.B、JAK／STAT通

4、路之間可能存在的cross-talk及其在肝細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化中的作用。 HCV為嗜肝細(xì)胞病毒，其自然宿主是人或黑猩猩，利用轉(zhuǎn)基因鼠或非人源肝細(xì)胞作為研究體系，不能真實(shí)反映HCV感染的自然進(jìn)程，所獲結(jié)果難以令人信服。本研究小組采用人源永生化肝細(xì)胞系QSG7701作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將表達(dá)HCV NS3蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒 (pcDNA3.l-NS3)轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞系QSG7701，建立穩(wěn)定表達(dá)HCV NS3蛋白的細(xì)胞系QSG7701

5、／NS3，李波博士成功進(jìn)行了鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用OSG7701、pcDNA3.l／QSG7701以及QSG7701／NS3①②③五組細(xì)胞，Western blot檢測(cè)HCV NS3蛋白對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。結(jié)果顯示QSG7701／NS3細(xì)胞中磷酸化的P38<'MAPK>和JNK的表達(dá)水平與pcDNA3.1／QSG7701和QSG7701細(xì)胞無(wú)明顯差異，但磷酸化的ERK(P44／42<'MAPK>)表達(dá)水平明顯升高，提示HCV NS3

6、蛋白可能通過(guò)增強(qiáng)ERK(P44／42<'MAPK>)的磷酸化而促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，從而在HCC發(fā)生中起作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終均通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子(如AP-1、NF-κB、STAT3)作用于細(xì)胞基因組調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為。本實(shí)驗(yàn)小組前期結(jié)果顯示HCV NS3蛋白上調(diào)AP-1、NF-κB、STAT3的DNA活性。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HCV NS3蛋白對(duì)cyclinDl表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示QSG7701／NS3細(xì)胞cyclinDl表達(dá)水平明顯高于ncDN

7、A3.1／QSG7701和QSG7701細(xì)胞。我們推測(cè)HCV NS3蛋白促進(jìn)QSG7701細(xì)胞增殖可能通過(guò)激活ERK／AP-1級(jí)聯(lián)，繼而上調(diào)cyclinDl實(shí)現(xiàn)的。 為了進(jìn)一步闡明HCV NS3蛋白通過(guò)ERK(P44／42<'MAPK>)信號(hào)通路的促細(xì)胞增殖作用，觀察ERK與NF-κB、JAK／STAT信號(hào)途徑間是否存在cross-talk以及它們?cè)诟渭?xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中作用，我們采用ERK激酶MEK的抑制劑PD98059(OμM

8、、30μM、50μM、100μM)處理QSG7701／NS3細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)ERK的磷酸化及cvclinDl的表達(dá)水平；凝膠電泳阻滯遷移試驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)AP-1、NF-κB、STAT3轉(zhuǎn)錄因子活性的改變；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞各周期百分?jǐn)?shù)的改變；MTT比色法觀察對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：PD98059處理QSG7701／NS3后，其ERK磷酸化水平和cyclinDl表達(dá)水平明顯降低；同時(shí)，AP-1、NF-κ