DES及INSL3對體外培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細胞中LGR8轉(zhuǎn)錄和表達的影響.pdf

1、目的:
　　近年來研究表明環(huán)境雌激素(EEs)對男性生殖系統(tǒng)的影響日益明顯,且大多數(shù)與睪丸的下降不全及發(fā)育不良有關(guān),而睪丸引帶在睪丸的下降和發(fā)育過程中一直被認為扮演著重要角色。研究證實胰島素樣因子3(INSL3)參與引帶發(fā)育、睪丸下降的過程。INSL3通過與其特異性受體LGR8結(jié)合而在第一階段(經(jīng)腹下降期)發(fā)揮主要作用,且LGR8高表達于睪丸引帶之上,但有關(guān)其具體作用機制尚未完全研究清楚。本實驗通過體外培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細胞,利用不

2、同濃度己烯雌酚(DES)和INSL3直接作用于培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞,以探討DES和INSL3對小鼠睪丸引帶細胞中LGR8 mRNA及蛋白表達的影響及其與小鼠睪丸下降的可能關(guān)系。
　　材料與方法:
　　將剛出生3日齡的雄性昆明小鼠顯微剖出其睪丸引帶組織并進行細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)后隨機分組,按DES濃度分為10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、DMSO溶劑對照組和正常對照組;按INSL3濃度分為20

3、ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml、0.02ng/ml和正常對照組。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并應(yīng)用免疫熒光對LGR8進行亞細胞定位。加藥持續(xù)作用48h,用Trizol法提取總RNA,紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度及完整性。然后應(yīng)用RT-PCR分析不同濃度DES及INSL3作用后小鼠睪丸引帶細胞中LGR8 mRNA的表達情況。將藥物作用48h后的細胞收集制成細胞懸液,通過流式細胞術(shù)分析小鼠睪丸引帶細胞中LGR8蛋白

4、的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.體外培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞大部分為成纖維樣細胞,有少數(shù)的上皮樣細胞。胞體呈梭形或不規(guī)則三角形,胞質(zhì)有突起。傳代后細胞仍呈成纖維細胞型生長,同源性好,存活率約90％。高劑量DES作用48h后細胞失去成纖維型形態(tài),胞漿收縮,胞體呈不規(guī)則類橢圓型。
　　2.細胞免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)LGR8表達于細胞膜上,且表達較高。
　　3. DES各實驗組與正常組相比,10μg/ml組睪丸引帶細胞LGR

5、8 mRNA及蛋白表達水平升高(P<0.01),1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml組表達下降(P<0.01或P<0.05),DMSO組LGR8 mRNA及蛋白水平的表達均無顯著性差異( P>0.05)。
　　4. INSL3各實驗組中0.02ng/ml組睪丸引帶細胞LGR8 mRNA及蛋白水平的表達高于正常對照組(P<0.01),20ng/ml、2ng/ml、0.2ng/ml組與正常組相比均無顯著性差異(P>0.0

6、5)。
　　結(jié)論:
　　1.體外培養(yǎng)小鼠睪丸引帶細胞呈成纖維細胞型生長,傳代后細胞同源性好,存活率高。大劑量DES可導(dǎo)致小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)異常、結(jié)構(gòu)紊亂。
　　2.免疫熒光確認LGR8在睪丸引帶細胞膜上表達,且表達較高。
　　3.高劑量的DES可使睪丸引帶細胞中LGR8的表達水平升高。
　　4.極低劑量的INSL3能上調(diào)睪丸引帶細胞中LGR8的表達量。
　　5.實驗證實高劑量的DES和極低劑量的IN