β2腎上腺素受體激動劑克倫特羅對睪丸間質(zhì)細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)體系中睪丸間質(zhì)細胞INSL3及3β-HSD的表達效應.pdf

1、目的：
　　1.應用3T3-L1脂肪細胞體外培養(yǎng)體系，探討克倫特羅（clenbuterol，CLB），萊克多巴胺（ractopamine，RAC）和齊帕特羅（zilpaterol，ZIL）對脂肪細胞過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptorγ，PPARγ）及脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）表達的影響及差異，闡明CLB，RAC，ZIL引起脂肪細胞內(nèi)分泌紊

2、亂的分子機制，以及三者對脂肪內(nèi)分泌紊亂相關性生殖疾病潛在的影響。
　　2.建立脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)模型，探討成熟脂肪細胞對睪丸間質(zhì)細胞胰島素樣因子（Insulin-like factor。INSL3）及3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）的表達效應，有助于闡明肥胖誘導男性不育癥的分子機制。
　　3.建立脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)模型，探討CLB對共培

3、養(yǎng)體系中睪丸間質(zhì)細胞INSL3及3β-HSD表達的影響，闡明CLB在脂肪內(nèi)分泌紊亂相關性男性生殖疾病中可能介導的環(huán)節(jié)。
　　材料與方法：
　　1.材料
　　1.13T3-L1脂肪細胞
　　3T3-L1前脂肪細胞株購自于中國科學院上海細胞庫，定向誘導為3T3-L1成熟脂肪細胞后進行實驗。
　　1.2 TM3睪丸間質(zhì)細胞
　　TM3睪丸間質(zhì)細胞由暨南大學禹艷紅老師惠贈，培養(yǎng)傳代后可進行實驗。
　　2

4、.實驗分組及給藥
　　2.13T3-L1脂肪細胞分組及給藥
　　本項實驗添加不同劑量的藥物培養(yǎng)12h，24h后分別收集細胞，進行細胞活性與PPARγ及ADP表達水平的檢測。本項實驗分組見表1。(此處圖表省略）
　　2.2共培養(yǎng)體系分組及給藥
　　將睪丸間質(zhì)細胞分別與成熟脂肪細胞，添加5μM CLB處理的成熟脂肪細胞共培養(yǎng)48小時，分別標記為脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)組，CLB處理脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)組；

5、另添加5μM CLB處理睪丸間質(zhì)細胞單獨培養(yǎng)，標記為CLB處理睪丸間質(zhì)細胞實驗組；將單獨培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細胞設為對照組。
　　3.實驗方法
　　3.13T3-L1前脂肪細胞誘導及鑒定
　　3T3-L1前脂肪細胞用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)液在37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。待細胞貼壁，生長至接觸抑制后2天進行成脂誘導分化，更換含有0.5mM IBMX、10μg/ml胰島素和1μM地塞米松的誘導劑及10%FB

6、S的DMEM高糖培養(yǎng)液。2天后，更換只含10μg/ml胰島素及10%FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2天換液1次。8-10天后，90%的細胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，可用于后續(xù)實驗。油紅O染色鑒定成熟脂肪細胞。
　　3.2 TM3睪丸間質(zhì)細胞的培養(yǎng)
　　TM3睪丸間質(zhì)細胞用含10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天換液1次，直至細胞融合達80%以上，可進行傳代。
　　3.3共培養(yǎng)體系的建立
　　采

7、用Transwell系統(tǒng)進行3T3-L1脂肪細胞和TM3睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)。3T3-L1脂肪細胞種入6孔培養(yǎng)板，經(jīng)誘導后，在Transwell小室種入TM3睪丸間質(zhì)細胞。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
　　3.43T3-L1脂肪細胞活性檢測
　　MTT分別檢測不同劑量CLB，RAC，ZIL對3T3-L1脂肪細胞活性的影響。
　　3.5脂肪因子PPARγ及ADP，睪丸間質(zhì)細胞INSL3及3β-HSD的表達

8、r>　　RT-PCR和Western blot檢測脂肪因子PPARγ、ADP，睪丸間質(zhì)細胞INSL3、3β-HSD表達水平的變化。
　　4.統(tǒng)計學方法
　　數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行分析。采用單因素方差分析（ANOVA），有統(tǒng)計學意義則用Tukey法作組間均數(shù)的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1.3T3-L1脂肪細胞誘導及鑒定
　　3

9、T3-L1前脂肪細胞生長接觸抑制后，經(jīng)誘導8-10天，3T3-L1前脂肪細胞可分化為成熟脂肪細胞。并經(jīng)油紅O染色鑒定，大約90%的3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞。
　　2. CLB，ZIL，RAC對3T3-L1脂肪細胞活性的影響及差異
　　與對照組相比，CLB，RAC，ZIL分別處理12h和24h后各劑量組細胞活性均呈下降趨勢，劑量越大，活性影響越大，差異顯著（P<0.05）。
　　培養(yǎng)12h，細胞活性：B組

10、0.05）；C組0.05），C組0.05）。培養(yǎng)24h。B組0.05）；C組　　3. CLB，ZIL，RAC對3T3

11、-L1脂肪細胞PPARγ及ADP表達的影響及差異
　　CLB，RAC，ZIL對PPARγ、ADP的表達影響基本呈一致性。CLB，RAC。ZIL均下調(diào)PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表達水平，且表達水平從高到低的順序為：低劑量組，中劑量組，高劑量組（P<0.05）。
　　培養(yǎng)12h，PPARγ的表達水平：B組0.05）；C組

12、2組，D組　　培養(yǎng)12h，ADP的表達水平：B組0.05）；D組0.05），B1組0.05）；C組

13、D2組，D1組0.05）。
　　4.脂肪細胞共培養(yǎng)及CLB對睪丸間質(zhì)細胞INSL3及3β-HSD表達的影響
　　與睪丸間質(zhì)細胞單獨培養(yǎng)對照組對比，CLB處理睪丸間質(zhì)細胞組INSL3表達下降，但無顯著差異（P>0.05），脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)組INSL3表達下降（P<0.05）；CLB處理脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)組INSL3下降程度

14、更大（P<0.05）。與睪丸間質(zhì)細胞單獨培養(yǎng)對照組對比，CLB處理睪丸間質(zhì)細胞組3β-HSD表達升高，但無顯著差異（P>0.05）；脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)組3β-HSD表達下降（P<0.05）；CLB處理脂肪細胞與睪丸間質(zhì)細胞共培養(yǎng)組3β-HSD下降程度更大（P<0.05）。
　　結論：
　　1. CLB，ZIL，RAC按影響程度從大至小依次降低脂肪細胞活性，下調(diào)PPARγ、ADP mRNA和蛋白的表達水平，并呈劑量依

15、賴性，提示 CLB，ZIL。RAC影響PPARγ和ADP的合成，可導致脂肪細胞內(nèi)分泌紊亂，從而可能引起脂肪內(nèi)分泌紊亂相關性生殖活動。
　　2.β2AR激動劑對脂肪細胞內(nèi)分泌功能的效應與激動劑種類相關，CLB，ZIL。RAC這3種激動劑對脂肪細胞產(chǎn)生效應不同，其中CLB影響最大，ZIL次之。RAC影響較小。
　　3.與脂肪細胞共培養(yǎng)下，睪丸間質(zhì)細胞INSL3與3β-HSD的表達下降可能是肥胖引發(fā)男性生殖疾病的重要機制；CLB與