體外培養(yǎng)人牙囊細胞血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達及其分子調(diào)控機制的研究.pdf

1、牙齒萌出是一個復(fù)雜且受到嚴密調(diào)控的過程。大量研究表明，牙囊在牙齒萌出中發(fā)揮重要的作用，其中一個重要原因就是牙囊中含有一系列牙齒萌出所必需的調(diào)控因子，包括巨噬細胞集落刺激因子-1（CSF-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，它們能夠趨化單核細胞進入牙囊并促使其形成破骨細胞，后者吸收牙槽骨形成牙齒萌出通道。 Wise 等在研究大鼠牙齒萌出過程中發(fā)現(xiàn)：破骨細胞的形成在大鼠出生后3d 達到一個高峰期，此時牙囊中的一些牙齒萌出調(diào)控

2、因子如CSF-1、MCP-1的表達均達到高峰，表明CSF-1、MCP-1 在破骨細胞形成這一高峰期發(fā)揮重要的作用。但是Wise 發(fā)現(xiàn)破骨細胞的形成在大鼠出生后10d 左右又達到一個高峰，而此時牙囊中CSF-1、MCP-1 等的表達均大大降低，因此Wise 等推測在第二個高峰期有另外一些因子促進破骨細胞的形成。2003 年Wise 等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠出生后10d 左右，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在牙囊中的表達達到高峰，推測VEGF 在破骨

3、細胞形成的第二個高峰期發(fā)揮重要作用。他們在隨后又進行了一些研究，證實了他們的推測。 但是Wise 等的研究結(jié)果是基于嚙齒動物的實驗，其結(jié)論是否適用于人類的牙齒萌出還不確定，而且目前有關(guān)VEGF 在牙齒萌出中作用的研究還缺乏系統(tǒng)性。許多問題如體外培養(yǎng)人牙囊細胞能否表達VEGF、VEGF 對人牙囊細胞的生物學(xué)作用及可能機制、其它牙齒萌出相關(guān)分子對人牙囊細胞VEGF表達的影響、調(diào)控人牙囊細胞VEGF 表達的信號通路、VEGF 對人牙

4、囊細胞OPG、RANKL 表達的影響等均還不清楚。 本課題將在以往研究的基礎(chǔ)上，通過體外培養(yǎng)人牙囊細胞，采用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)有關(guān)方法，比較系統(tǒng)地研究人牙囊細胞VEGF 表達及可能信號調(diào)節(jié)機制、VEGF 對人牙囊細胞增殖、分化、凋亡的影響及可能機制、VEGF 參與牙齒萌出過程中破骨細胞形成和分化的機理等，以探討VEGF 參與牙齒萌出的生物學(xué)機制。本課題的結(jié)果將有助于闡明牙齒萌出的分子機制，也為臨床阻生牙的正畸矯治以及牙胚的

5、組織工程研究等提供理論基礎(chǔ)。 本課題的研究內(nèi)容如下： 第一部分：體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF 的表達 目的：觀察體外培養(yǎng)的人牙囊細胞能否表達VEGF。 方法：取一名12 歲男孩因正畸需要拔除的下頜第三磨牙的牙囊組織，采用組織塊和酶消化相結(jié)合的方法體外培養(yǎng)人牙囊細胞，觀察細胞形態(tài)，并選取第4 代細胞進行波形絲蛋白和角蛋白免疫細胞化學(xué)染色鑒定其細胞來源。然后選取第4 代人牙囊細胞，采用免疫細胞化學(xué)染色、反轉(zhuǎn)

6、錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）三種方法檢測VEGF 的表達。 結(jié)果：在體外成功培養(yǎng)出人牙囊細胞，絕大多數(shù)細胞呈典型的成纖維樣細胞形態(tài)，抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性，證明細胞來源于外胚間充質(zhì)。人牙囊細胞抗VEGF染色陽性，陽性部位位于胞漿。RT-PCR 檢測到人牙囊細胞VEGF mRNA 的表達。在人牙囊細胞培養(yǎng)上清液中檢測到VEGF 蛋白。 結(jié)論：用組織塊結(jié)合酶消化法在體外成

7、功培養(yǎng)出人牙囊細胞，經(jīng)鑒定細胞來源于外胚間充質(zhì)。體外培養(yǎng)的人牙囊細胞能夠合成并分泌VEGF。 第二部分：VEGF 對體外培養(yǎng)人牙囊細胞生物學(xué)特性的影響 目的：觀察VEGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞增殖、分化、凋亡的影響并探討可能的作用機制。 方法：將生長狀態(tài)良好的第4代人牙囊細胞接種于96孔培養(yǎng)板上，分別與不同濃度的VEGF孵育3d或與100ng/mL VEGF孵育不同時間，檢測VEGF對人牙囊細胞增殖和堿性磷酸酶活

8、性的影響。將VEGF和MAPK抑制劑不同組合加入到96孔培養(yǎng)板的細胞中，檢測MAPK抑制劑對VEGF介導(dǎo)的牙囊細胞增殖的作用。采用流式細胞儀技術(shù)觀察VEGF對人牙囊細胞凋亡的作用。 結(jié)果：VEGF在10~300ng/mL范圍內(nèi)能明顯提高人牙囊細胞的增殖水平和堿性磷酸酶活性（P<0.01）。VEGF處理組人牙囊細胞的增殖水平在孵育后1、3、5、7d均明顯高于對照組（P<0.01），而VEGF處理組人牙囊細胞堿性磷酸酶活性在孵育后

9、3、5、7d明顯高于對照組（P<0.01）。MAPK抑制劑能削弱VEGF介導(dǎo)的人牙囊細胞增殖。VEGF處理組人牙囊細胞的凋亡率略低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：VEGF在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進體外培養(yǎng)人牙囊細胞的增殖，但無明顯抑制牙囊細胞凋亡的作用。MAPK信號通路是VEGF促進人牙囊細胞增殖的一條可能途徑。VEGF還能促進體外培養(yǎng)人牙囊細胞堿性磷酸酶活性的升高，提示VEGF可能是促使牙囊細胞向成骨細胞/

10、成牙骨質(zhì)細胞表型分化的一種誘導(dǎo)因子。 第三部分：TNF-α、bFGF對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達的影響 目的：研究TNF-α、bFGF 對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF 表達的影響。 方法：選取生長狀態(tài)良好的第4 代人牙囊細胞，采用RT-PCR 及ELISA 分別檢測TNF-α (bFGF)對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF mRNA 表達及上清液中VEGF含量改變的濃度和時間效應(yīng)。 結(jié)果：①不同濃度TNF

11、-α作用1h 后, TNF-α處理組人牙囊細胞VEGF mRNA 表達均較對照組增強(P<0.05)，最佳效應(yīng)濃度為25ng/mL；不同濃度TNF-α作用12h 后，除1ng/mL 組外，其余各組上清液中VEGF 蛋白含量明顯高于對照組(P<0.05)。②在時間效應(yīng)上，25ng/mLTNF-α作用1h 后人牙囊細胞VEGF mRNA 表達最強，然后隨時間延長其表達逐漸下降，但仍強于對照組(P<0.05)；細胞培養(yǎng)上清液中VEGF 蛋白含

12、量隨時間延長逐漸增加，但TNF-α處理組VEGF 蛋白含量高于對照組(P<0.05)。③不同濃度bFGF 作用6h 后, bFGF 處理組人牙囊細胞VEGF mRNA 表達均較對照組增強(P<0.05)，最佳效應(yīng)濃度為10ng/mL；不同濃度bFGF 作用12h后，bFGF 處理組上清液中VEGF 蛋白含量明顯高于對照組(P<0.05)。④在時間效應(yīng)上，bFGF 作用1、3、6、12h 后人牙囊細胞VEGF mRNA 表達均較對照組顯著

13、增強(P<0.01)，其中bFGF 作用6h 后VEGF mRNA 表達最強；細胞培養(yǎng)上清液中VEGF 蛋白含量隨時間延長逐漸增加，但bFGF 處理組VEGF蛋白含量高于對照組(P<0.01)。 結(jié)論：TNF-α、bFGF 能夠促進體外培養(yǎng)人牙囊細胞合成并分泌VEGF。 第四部分：PKC、cAMP/PKA 信號通路在調(diào)控體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達中的作用 目的：探討PKC、cAMP/PKA 信號通路在調(diào)

14、控體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF表達中的作用。 方法：選取生長狀態(tài)良好的第4 代人牙囊細胞，采用Real-timePCR 分別檢測PKC 激動劑（PMA）、PKC 非特異性抑制劑（G?6983）、PKC-α和γ特異性抑制劑（HBDDE）、PKC-β特異性抑制劑（LY333531）、cAMP/PKA激動劑（dbcAMP）和抑制劑（KT5720）對體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF mRNA表達的影響。 結(jié)果：PMA 組和PMA＋H

15、BDDE 組VEGF mRNA 的表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而PMA＋G?6983 組和PMA＋LY333531 組VEGF mRNA 的表達水平與對照組之間無明顯差異（P>0.05）。dbcAMP 組VEGF mRNA 的表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而dbcAMP＋KT5720 組VEGF mRNA 的表達水平與對照組之間無明顯差異（P>0.05）。 結(jié)論：PKC

16、、cAMP/PKA 信號通路均參與體外培養(yǎng)人牙囊細胞VEGF 表達的調(diào)控，其中PKC 信號通路中參與調(diào)控的亞單位是PKC-β。 第五部分：VEGF 對體外培養(yǎng)人牙囊細胞OPG、RANKL 表達的影響 目的：探討VEGF 對體外培養(yǎng)人牙囊細胞OPG、RANKL 表達的影響。 方法：將生長狀態(tài)良好的第4 代人牙囊細胞與25ng/mL VEGF 孵育不同時間后，采用RT-PCR 分別檢測OPG mRNA、RANK

17、L mRNA 表達的變化，采用ELISA 檢測上清液中OPG 蛋白含量變化。 結(jié)果：人牙囊細胞與VEGF 孵育6h 后RANKL mRNA 表達最強，與對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其余各組RANKL mRNA 表達水平較對照組略有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。人牙囊細胞與VEGF 孵育1h 后OPG mRNA 表達水平開始下降，但與對照組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。孵育3h 后OPG

18、mRNA 表達顯著降低，與對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。以后OPG mRNA表達水平逐漸恢復(fù)，與對照組之間無明顯差異（P>0.05）。細胞培養(yǎng)上清液中OPG 蛋白含量隨時間延長逐漸增加，但VEGF 處理組OPG 蛋白含量低于對照組（P<0.05）。 結(jié)論：VEGF 能夠抑制體外培養(yǎng)人牙囊細胞OPG 的表達，促進其RANKL 的表達，通過RANKL-RANK-OPG 軸調(diào)節(jié)破骨細胞的形成和分化，參與牙齒萌出的調(diào)控