E64d對腦外傷后神經細胞質膜完整性和神經功能的影響及相關機制.pdf

1、目的：研究E64d通過凋亡-自噬途徑對TBI后神經細胞質膜完整性及神經功能的作用,并對其調節(jié)機制進行初步探討。
　　 方法：采用改良的自由落體損傷裝置建立小鼠定量腦外傷(traumatic braininjury,TBI)模型,實驗組側腦室注射E64d(cathepsinB和μ-calpain的特異性抑制劑,0.5μg/1μ1)或等體積1％DMSO,并按傷后時間不同分為傷后1h,6h,12h,24h,和48h組,各組分別于處死前

2、1h用腹腔注射法將碘化丙啶(propidium iodide,PI)注入各組小鼠體內,采用體視學顯微鏡計數各組損傷及其周邊區(qū)(皮質與海馬)陽性細胞數,研究組織蛋白酶對TBI引起的神經細胞質膜完整性破壞的影響；用組織缺損體積(lesion volume,LV)評估TBI后腦組織損害的情況,研究組織蛋白酶對TBI后腦組織損害的影響；采用行為學試驗(Motor Test和Morris水迷宮試驗)評估TBI后各組動物的運動和學習記憶的情況,研究

3、組織蛋白酶對TBI后神經功能損害的影響。運用Western blot法和免疫組織熒光法觀察TBI后各實驗組腦組織中凋亡相關蛋白caspase-3,bcl-2,tBid,bax,自噬/溶酶體途徑相關蛋白cathepsinB,LC3,P62的表達情況,進一步研究溶酶體酶對凋亡和自噬通路的影響以及兩種通路的相互關系,期望為E64d對TBI后神經細胞質膜完整性及神經功能保護的調節(jié)機制提供理論依據。
　　 結果：PI計數,形態(tài)學、蛋白質學

4、和行為學檢測結果顯示,與相對應各時段DMSO對照組比較,用E64d阻滯cathepsinB和μ-calpain后,損傷區(qū)PI陽性細胞數減少,缺損體積減小,運動和學習記憶功能有所改善；凋亡相關蛋白(caspase-3、tBid、bax)、自噬/溶酶體途徑相關蛋白(cathepsinB、P62)的表達量降低,且以24h~48h最為顯著(P＜0.05)；抗凋亡蛋白bcl-2和自噬相關蛋白LC3Ⅱ表達量顯著增加(P＜0.05)。
　　

5、結論：1.TBI可以造成神經細胞質膜完整性破壞,TBI后24h～48h質膜完整性遭破壞的細胞數量達高峰,表現(xiàn)為PI陽性細胞顯著增多；E64d可以減輕TBI造成的神經細胞質膜完整性破壞程度；2.E64d可以減小TBI后腦組織的缺損體積；3.TBI可引起運動和學習記憶功能損害,E64d可以明顯改善TBI后運動和學習記憶功能；4.自噬/溶酶體途徑、凋亡途徑均參與腦外傷的病理過程；5.E64d抑制cathepsinB和μ-calpain后凋亡和