胡蘿卜高效再生體系的建立及其輪狀病毒免疫相關(guān)蛋白基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、輪狀病毒是世界范圍內(nèi)引起嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體,尤其是發(fā)展中國家,每年受輪狀病毒危害的嬰幼兒數(shù)量非常巨大.目前,對輪狀病毒感染最有效的預(yù)防和控制措施,是發(fā)展有效的疫苗.vp7和vp4是輪狀病毒的主要外殼蛋白和中和抗原,vp6是主要的病毒蛋白,能誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG抗體和IgA抗體,與保護(hù)性免疫有關(guān).這三個基因的研究受到了基因工程疫苗研究者的廣泛關(guān)注.該試驗(yàn)以紅秀CT黑田五寸人參和新透心紅胡蘿卜的下胚軸為受體材料,將編碼輪狀病毒主要蛋白的

2、vp7、vp6和vp4基因,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入胡蘿卜,獲得了轉(zhuǎn)基因植株.并從無菌苗的獲得、愈傷組織誘導(dǎo)、選擇壓、共培養(yǎng)時間、愈傷組織再生及再生苗的管理等各個階段的培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究和優(yōu)化,篩選并得到了以胡蘿卜下胚軸為外植體穩(wěn)定完整的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系.主要研究結(jié)果如下:1.通過對植株再生各個時期因素的研究和優(yōu)化,建立了完整的胡蘿卜再生體系.確定種子的最佳滅菌條件是1%AgNO3振蕩消毒15~20 min;紅秀CT黑田五寸人參的

3、最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基及激素組合為B5+0.1mg/L 2,4-D+0.2mg/L KT,新透心紅的最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和激素組合為MS+0.1mg/L 2,4-D;MS培養(yǎng)基有利于再生植株的生根;再生植株在培養(yǎng)瓶中的煉苗時間以7~10 d為宜.2.建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效胡蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化體系,并將vp7、vp6和vp4基因成功導(dǎo)入胡蘿卜.7~9 d苗齡的胡蘿卜下胚軸浸染農(nóng)桿菌15~20 min,共培養(yǎng)2~3 d后,轉(zhuǎn)入附加75 mg/L

4、 Kan+500 mg/L Carb的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,待形成抗性愈傷組織后,繼代到附加120 mg/L Kan+300 mg/L Carb的植株再生培養(yǎng)基上,50 d后可得到Kan抗性苗.3.經(jīng)過幾次Kan的篩選,得到Kan抗性植株421棵.并對其進(jìn)行了PCR檢測.204棵轉(zhuǎn)vp7基因的Kan抗性植株中,有62棵為PCR陽性;120棵轉(zhuǎn)vp6基因的Kan抗性植株中,有33棵為PCR陽性;97棵轉(zhuǎn)vp4基因的Kan抗性植株中,有21