豆科作物高效器官再生體系的建立及其在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用.pdf

1、豆科作物在人類經(jīng)濟生活和生態(tài)環(huán)境中具有重要的作用。遺傳轉(zhuǎn)化為新種質(zhì)的創(chuàng)建和功能基因組的研究提供了新的工具。豆科作物的遺傳轉(zhuǎn)化受其再生頑拗性的限制，現(xiàn)有的再生體系多存在再生效率低且基因型依賴性強等不足。開發(fā)高效的再生體系有利于推動遺傳轉(zhuǎn)化以及相關(guān)研究的進程。
　　 本研究以豌豆品種“Espace”為材料，將豌豆種子直接置于含有苯基噻二唑基脲（TDZ）的培養(yǎng)基上進行叢生芽誘導，器官再生頻率高達100％。每粒種子產(chǎn)生的叢生枝數(shù)量取決于

2、TDZ的濃度和TDZ培養(yǎng)時間。在TDZ為4mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)12周后，每粒種子產(chǎn)生的叢生枝數(shù)量可達到200多個。高濃度生長素可以克服TDZ對生根的抑制作用，使生根效率達到90％以上。在TDZ培養(yǎng)基上，當豌豆幼苗連續(xù)培養(yǎng)4周以上時，莖節(jié)處的腋芽分生組織形成叢生芽組織，在TDZ培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)能長久維持其再生潛能。在叢生枝伸長培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)16周后，每克鮮重叢生芽組織產(chǎn)生的叢生枝數(shù)量可達700多個。將該體系應(yīng)用于其它7個基因型時，叢

3、生枝狀植株和叢生芽組織形成的效率仍然很高，根據(jù)外植體在TDZ培養(yǎng)基上的生長形態(tài)很容易地確定形成叢生芽組織所需的最佳TDZ濃度。
　　 為了建立穩(wěn)定、可靠的轉(zhuǎn)化體系，我們利用攜帶熒光素酶報告基因的農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGLO侵染萌發(fā)的“Espace”種子及其叢生芽組織。結(jié)果表明：外植體的類型以及共培養(yǎng)的有無對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率沒有顯著的影響。將叢生芽組織繼代培養(yǎng)的特性和熒光素酶基因的指示作用相

4、結(jié)合能夠有效地除去非轉(zhuǎn)化組織，純化的轉(zhuǎn)基因組織系產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株的效率可達到88％，大多數(shù)植株能夠產(chǎn)生具有熒光素酶活性的T1和T2代種子。Southern檢測表明外源基因已整合入豌豆基因組。
　　 為了探索繼代培養(yǎng)體系在其他物種中應(yīng)用的可行性，我們以大豆為對象進行了實驗。將大豆品種“白臍”的種子置于TDZ培養(yǎng)基上直接萌發(fā)，1周后分離子葉節(jié)并轉(zhuǎn)入含有芐基腺嘌呤（BA）的培養(yǎng)基中，經(jīng)6-8周培養(yǎng)后在子葉節(jié)處形成叢生芽組織。我們注意到：

5、只有含有腋芽的子葉節(jié)才能形成叢生芽組織。通過在MS0.1T培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)，叢生芽組織可通過自身存在的分生細胞繁殖長期維持其再生能力。在含有0.5mg/L芐基腺嘌呤的伸長培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，每克鮮重叢生芽組織可產(chǎn)生的叢生枝多達336個。叢生枝的生根率達90％以上，再生植株移入溫室后全部成活并表現(xiàn)為可育。在其他4個基因型上應(yīng)用該系統(tǒng)也獲得了大量的叢生芽組織，表明該體系沒有明顯的基因型依賴性。
　　 根據(jù)TDZ在豌豆和大豆器官再生

6、中的作用規(guī)律，對花生、菜豆和油菜進行了相似的試驗并建立了相似的叢生芽繼代培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：在豆科作物中，外植體中腋芽分生組織的存在對叢生芽組織的形成是非常必要的。但每個作物形成叢生芽組織所需的最佳TDZ濃度顯著不同，根據(jù)外植體在TDZ培養(yǎng)基上的形態(tài)反應(yīng)很容易確定形成叢生芽組織所需要的最佳濃度。由叢生芽組織發(fā)育而來的叢生枝均可生根并形成可育植株。因此，以腋芽分生組織的繁殖為基礎(chǔ)的叢生芽組織繼代培養(yǎng)體系可以被推廣至更廣泛的基因型和更多的作