不同氮源對殺線蟲真菌BHO531的影響及代謝物活性組分分析.pdf

1、植物寄生線蟲是一類世界性分布的重要植物病原物，其寄生范圍廣，環(huán)境適應(yīng)性強，幾乎每種作物都受到植物線蟲的侵害。真菌殺線劑是一類環(huán)境友好型生防因子，越來越受到廣泛重視。海洋來源的枝頂孢霉(Acremnium，BH0531)是一株已被證實具有較好殺線蟲作用的海洋真菌。其代謝產(chǎn)物具有分子量小、水溶性好、熱穩(wěn)定性強、殺線蟲活性高等特點。本文在原有培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上對不同氮源對BH0531生長情況的影響進(jìn)行了比較探究，并對代謝產(chǎn)物中殺線蟲有效組分進(jìn)行

2、初步分離和分析測定，主要研究成果如下:
　　1.不同氮源對BH0531生長的影響
　　改變察氏培養(yǎng)基的氮源種類，探究分別添加1g/L、2g/L、3g/L、4g/L的NaNO3、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏8種氮源對海洋枝頂孢霉(Acremoniumsp.BH0531)菌體生長量以及代謝產(chǎn)物對松材線蟲、黃瓜根結(jié)線蟲二齡幼蟲存活的影響。測定結(jié)果顯示:
　　(1)不同氮源對B

3、H0531菌絲體的表觀有明顯的影響。有機氮源中，菌絲體外觀結(jié)構(gòu)相對緊密，呈均勻球狀分布，直徑明顯大于無機氮源條件;無機氮源中，發(fā)酵液透明，呈淡黃色，菌絲體結(jié)構(gòu)松散，多不成球，絮狀或外觀不規(guī)整。
　　(2)不同氮源對菌體的生長明顯的影響(α=0.05)，其對菌體生長的作用效果依次為:蛋白胨＞酵母膏＞牛肉膏＞KNO3＞NaNO3＞(NH4)SO4＞NH4NO3＞NH4Cl。菌體的生物量不僅受氮源種類的影響，還受到氮源含量的影響。有機氮

4、源中表現(xiàn)出與含量成正相關(guān)的趨勢，而無機氮源含量與菌體的生長量隨濃度變化顯現(xiàn)出拋物線關(guān)系。此外，發(fā)酵液的pH也與氮源的類型相關(guān)，BH0531經(jīng)有機氮源發(fā)酵液后，代謝產(chǎn)物的pH值為5.8左右，而經(jīng)無機氮源發(fā)酵液后pH在3.9～6.5之間。
　　(3)殺線蟲活性測定結(jié)果顯示，發(fā)酵液有無殺線蟲活性與菌體生長量無相關(guān)性，但與pH有一定的關(guān)聯(lián)，接近中性的發(fā)酵液殺線蟲活性相對較高。其中，對松材線蟲的測試表明，以硝態(tài)氮的NaNO3、KNO3為氮源

5、的發(fā)酵液具有較高的殺線蟲活性。1g/L、2g/L、4g/L的NaNO3發(fā)酵液對松材線蟲第3d的校正死亡率分別為96.05％、95.66％、93.37％，對根結(jié)線蟲第3d的校正死亡率在61.96％～92.72％之間。
　　2.發(fā)酵液小分子活性物質(zhì)的分離及殺線蟲活性測定
　　BH0531經(jīng)海水培養(yǎng)基發(fā)酵后，通過截流分子量為6000dalton的UEOS-503型中空纖維膜組件超濾即獲得發(fā)酵液小分子濾液。經(jīng)真空干燥后(0.09MP

6、a，70℃)的小分子組分呈棕黃色為晶體狀顆粒，表明BH0531菌株所產(chǎn)殺線蟲活性物質(zhì)具有結(jié)晶的性能，干燥物得率為12.807g·L-1。
　　發(fā)酵液小分子組分經(jīng)過D315陰離子交換樹脂除酸后，其對松材線蟲5d的校正死亡率可達(dá)84.75％。經(jīng)過D115陽離子交換樹脂除堿后的分離液，對松材線蟲與根結(jié)線蟲5d的死亡率分別達(dá)到76.5％和80.01％。
　　進(jìn)一步用AB-8大孔吸附樹脂分別分離D315和D115交換物發(fā)現(xiàn):從未吸附組

7、分到45％乙醇洗脫液所得的5組液體中，對松材線蟲和黃瓜根結(jié)線蟲的最高殺線率僅為51.35％和49.32％。離子交換的結(jié)果排除了酸根本身或陽離子本身的作用;AB-8大孔吸附樹脂分離的結(jié)果排除了非極性物質(zhì)的惟一性，據(jù)此推測活性代謝物可能具有兩性物質(zhì)的特性。
　　用SephadexG-25分離獲得的30管組分中，第14、15管在第3d對松材線蟲的殺線率分別是90.11％與94.30％，14、15、16管對根結(jié)線蟲第3d的校正死亡率分別為

8、90.68％、92.86％、91.21％。鑒于SephadexG-25的分辨率介于1000-5000之間，可以判斷活性組分的分子量小于5000 dalton。
　　3.發(fā)酵液小分子活性物質(zhì)性質(zhì)的分析
　　G-25分離所得的各組分經(jīng)紫外-可見全波長掃描發(fā)現(xiàn)在200-400nm間有吸收峰，存在n-π*躍遷，提示活性物可能含有C=O、C=S、-N=O、-N=N-、C=N等基團(tuán)存在。
　　進(jìn)一步的紙色譜定性分析結(jié)果顯示，活性物

9、中鄰羥基、多羥基醇、糖醛酸等基團(tuán)顯色反應(yīng)為陽性，提示有相關(guān)基團(tuán)存在。
　　對紅外光譜檢測圖譜顯示，3400.52cm-1處是羥基或羧酸羥基的特征吸收峰，1092.74cm-1處為C-O鍵，1100cm-1處是C-F的強吸收峰，1633.6cm-1附近的峰可能是C=O伸縮振動或伯胺的吸收峰，查詢結(jié)果顯示，席弗堿類物質(zhì)在該處有吸收峰，提示活性物可能具有類似基團(tuán)或結(jié)構(gòu)。高效液相色譜測定結(jié)果表明，與標(biāo)樣氨基酸相比，未檢測到氨基酸存在，因而