繩狀青霉耐酸分子機(jī)制研究.pdf

1、自然界中，各種極端環(huán)境下均有生物體存在，如高溫、強(qiáng)酸堿性條件、鹽度、高壓及輻射條件。生存在極端環(huán)境下的生物稱為極端微生物。各種微生物適應(yīng)極端環(huán)境的機(jī)制為研究大多數(shù)物種在其生物進(jìn)程中的基本特征提供了獨(dú)特的視角。嗜酸微生物是指能夠在pH1.0下生長(zhǎng)，且在pH小于4.0時(shí)活躍生長(zhǎng)的微生物，其耐酸的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。
　　本論文進(jìn)行了繩狀青霉X33耐酸分子機(jī)制的探索。分離得到一株耐酸的繩狀青霉X33，該菌具有廣泛的生長(zhǎng)pH范圍，為pH0.

2、6-13.0。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法建立了繩狀青霉X33轉(zhuǎn)化系統(tǒng)并進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了T-DNA插入突變體庫(kù)。針對(duì)轉(zhuǎn)化過程中4個(gè)關(guān)鍵因素，即繩狀青霉X33孢子的新鮮程度、預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中AS的有無以及濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、繩狀青霉X33孢子懸液和農(nóng)桿菌菌液的比例，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)繩狀青霉X33轉(zhuǎn)化效率的影響建立了高效的生長(zhǎng)青霉轉(zhuǎn)化體系。利用該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)建了含有9300株轉(zhuǎn)化子的突變體庫(kù)，Southern雜交顯示轉(zhuǎn)化子基因組中，T-DN

3、A插入拷貝數(shù)為1-2個(gè)，其中87.7％為隨機(jī)單拷貝插入。對(duì)繩狀青霉X33 T-DNA插入突變體庫(kù)進(jìn)行表型篩選，發(fā)現(xiàn)了幾株形態(tài)異常的突變子。
　　以不耐酸突變體M4為研究對(duì)象，利用TAIL-PCR技術(shù)，克隆得到一個(gè)基因，命名為PfMFS（基因號(hào):KF815490）。經(jīng)比對(duì)，該基因與馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffeiATCC18224)保守的假想蛋白(XP_002144911)具有88％的同源性。它包含一個(gè)165

4、6bp的開放閱讀框ORF，編碼551個(gè)氨基酸。BLASTP分析顯示，該基因編碼的氨基酸是主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(MFS)成員。這些結(jié)果顯示，該假想蛋白是一種新的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體，但是其功能尚不清楚。
　　序列分析可知，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中T-DNA插入在PfMFS基因的啟動(dòng)子區(qū)-372。為了進(jìn)一步確定PfMFS基因在繩狀青霉X33耐酸性狀中的作用，為此我們采用以同源重組為基礎(chǔ)的基因敲除技術(shù)，利用農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化方法將野生菌的PfMFS基因

5、敲掉，并通過Southern雜交和PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示PfMFS基因缺失突變株在pH1.0生長(zhǎng)極為緩慢，進(jìn)一步說明PfMFS基因在繩狀青霉X33耐酸性狀中發(fā)揮作用。
　　通過回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，以質(zhì)粒p3SR2為骨架構(gòu)建了回補(bǔ)載體p3SR2-PfMFS，采用電擊轉(zhuǎn)化萌發(fā)孢子方法，將PfMFS基因重新導(dǎo)入敲除突變體M7，并用RT-PCR、Northern雜交等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。該數(shù)據(jù)說明突變體M4和M7性狀的改變是PfMFS基因的作用。

6、r>　　為了測(cè)定繩狀青霉X33原生質(zhì)體體內(nèi)pH，制備了原生質(zhì)體，用高效熒光探針BCECF-AM進(jìn)行測(cè)定。敲除突變體M7由于PfMFS基因被破壞，其原生質(zhì)體內(nèi)pH較野生菌低。這一結(jié)果顯示了PfMFS基因在維持繩狀青霉X33細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)的重要性。
　　為了進(jìn)一步研究PfMFS基因的生物學(xué)功能，進(jìn)行了異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)。酵母轉(zhuǎn)化子PfMFS-22在pH2.0的YPD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況好于含空載的酵母，在pH1.0下都不生長(zhǎng)，pH3.0生長(zhǎng)幾

7、乎相同。結(jié)果說明，繩狀青霉X33 PfMFS基因在低pH下對(duì)酸性環(huán)境具有抵抗能力。
　　繩狀青霉X33敲除突變體M7對(duì)NaCl不敏感，野生菌在NaCl存在的情況下生長(zhǎng)量增加。在原生質(zhì)體懸浮液pH的測(cè)定實(shí)驗(yàn)，原生質(zhì)體懸浮液中加入25mM的NaCl，測(cè)其pH，結(jié)果顯示加入NaCl之后，野生菌的pH顯著降低，而敲除突變體幾乎不變。結(jié)果說明，Na+與PfMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)聯(lián)，PfMFS轉(zhuǎn)運(yùn)體可能是一個(gè)Na+依賴性MFS運(yùn)轉(zhuǎn)體。
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