脫二氧喹賽多、脫二氧乙酰甲喹抗體制備及酶聯(lián)免疫吸附檢測方法的建立.pdf

1、喹賽多和乙酰甲喹是人工合成的獸藥，屬于喹噁啉類藥物，具有良好的抗菌及促生長作用，被廣泛用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。研究表明，喹賽多與同類藥物相比毒性小、安全性較好，但其一些代謝產(chǎn)物多對動物存在潛在毒性，會引起食品安全問題。乙酰甲喹的毒性相對較大，長期使用或濫用會危害動物和人類的健康。因此，建立一種快速、靈敏的檢測方法檢測動物可食性組織中喹賽多和乙酰甲喹的殘留情況有重大意義。本研究分別以脫二氧喹賽多和脫二氧乙酰甲喹為研究對象，旨在建立一種快速、靈敏

2、、高通量的基于抗體的免疫學(xué)殘留檢測方法---酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。
　　 脫二氧喹賽多(Cy4)是喹賽多的一種主要代謝產(chǎn)物，已被確定為其殘留標(biāo)志物。本論文根據(jù)脫二氧喹賽多的結(jié)構(gòu)特征，通過羧甲基羥胺的肟化作用引入羧基，再采用混合酸酐法與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)，合成了免疫抗原Cy4-BSA和檢測抗原Cy4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后獲得了效價高、靈敏度較高的多克隆抗體，取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤進(jìn)行細(xì)胞

3、融合，經(jīng)三次細(xì)胞克隆和篩選，獲得了3株能穩(wěn)定分泌Cy4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(A3C5、D9D2、F10D2)。制備了單克隆抗體腹水，并采用辛酸-飽和硫酸銨法對腹水進(jìn)行純化。經(jīng)檢測，這三種雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體的類型均為IgG2b，輕鏈為λ鏈，效價為1∶128000-1∶512000，且與其他結(jié)構(gòu)類似物基本沒有交叉反應(yīng)，特異性較好。
　　 本論文選用D9D2雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測方法的建立。通過優(yōu)化

4、各反應(yīng)條件建立間接競爭ELISA(ic-ELISA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的靈敏度(IC50)為50 ng/mL，靈敏度比多克隆抗體提高了200倍，線性范圍為(IC20-IC80)6.2-481.1 ng/mL。在雞肉中添加脫二氧喹賽多的量在4-4000μg/kg時，其回收率為71.36％-83.10％，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均＜10％。本研究建立了一種基于單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，其靈敏度高、特異性好，可用于檢測喹賽多在動物可食性組織中

5、的殘留。
　　 脫二氧乙酰甲喹(M4)是乙酰甲喹的一種主要代謝產(chǎn)物，已被確定為其殘留標(biāo)志物。本論文根據(jù)脫二氧乙酰甲喹的結(jié)構(gòu)特征，通過羧甲基羥胺的肟化作用引入羧基，再采用混合酸酐法與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)，合成了免疫抗原M4-BSA和檢測抗原M4-OVA。免疫雌性Balb/C小鼠后獲得了多克隆抗體。經(jīng)檢測其效價為1∶16000-1∶32000，效價較高;靈敏度(IC50)為0.32μg/mL-12.38μg/mL;與少部分