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1、腹腔注射17β—雌二醇(E2),使瓦氏黃顙魚(yú)(P.vachelli)雄魚(yú)在7d內(nèi)產(chǎn)生卵黃蛋白原(Vtg)。采用凝膠過(guò)濾和離子交換兩步層析法、Mg2+—EDTA選擇性沉淀和凝膠過(guò)濾層析兩步法、Mg2+—EDTA選擇性沉淀和電洗脫兩步法等三種技術(shù),從E2誘導(dǎo)的雄性瓦氏黃顙魚(yú)血漿中分離、純化Vtg,采用糖、磷、脂蛋白染色技術(shù)證明分離、純化的蛋白為Vtg,該Vtg在非變性條件下分子量約為240kDa,在SDS變性條件下分子量約為143kDa。純
2、化的瓦氏黃顙魚(yú)Vtg經(jīng)檢測(cè)顯示可能含有類胡蘿卜素,但沒(méi)有二硫鍵,對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定。利用純化的瓦氏黃顙魚(yú)Vtg,制備了兔抗瓦氏黃顙魚(yú)Vtg多克隆抗血清。用雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)得抗血清的純度較高,效價(jià)為1:32:Western blotting檢測(cè)顯示抗血清的特異性較好。以瓦氏黃顙魚(yú)Vtg多克隆抗血清為抗體,以純化的瓦氏黃顙魚(yú)Vtg為抗原,建立了間接酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法檢測(cè)瓦氏黃顙魚(yú)體內(nèi)Vtg的含量,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性部分的線性方程為y=0
3、.099x+0.4529(R2=0.9327),該方法檢測(cè)的靈敏度為15.6ng/ml,工作范圍為31.2-4000ng/ml,在此范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性。 采用凝膠過(guò)濾和離子交換兩種層析技術(shù),從瓦氏黃顙魚(yú)Ⅳ期卵巢粗體液中分離、純化Lv,采用糖、磷、脂蛋白染色技術(shù)證明分離、純化的蛋白為L(zhǎng)v,該Lv在非變性條件下分子量約為230kDa,在SDS變性條件下分子量約為106kDa。純化的瓦氏黃顙魚(yú)Lv經(jīng)檢測(cè)顯示可能含有類胡蘿卜
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