2011年--外文翻譯--sirt3 通過(guò)干擾hif-1a抵制癌細(xì)胞代謝的重編程（譯文）

1、<p><b>　　中文8180字</b></p><p>　　出處：Constantinides A, Chotani G K. SIRT3 opposes reprogramming of cancer cell metabolism through HIF1α destabilization.[J]. Cancer Cell, 2011, 19(3):416–428.<

2、/p><p>　　Sirt3 通過(guò)干擾HIF-1a抵制癌細(xì)胞代謝的重編程</p><p><b>　　概述</b></p><p>　　腫瘤細(xì)胞即使在正常氧環(huán)境下也會(huì)表現(xiàn)出較高的糖酵解。這種代謝的重編程被稱作Warburg 效應(yīng)，它會(huì)給腫瘤細(xì)胞提供細(xì)胞增殖所需的底物。在這里，我們介紹一種線粒體內(nèi)的NAD依賴型去乙?；竤irt3，這是調(diào)節(jié)Warbu

3、rg效應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵因子。從機(jī)制上來(lái)說(shuō)，sirt3 會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)一種轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a控制糖酵解過(guò)程中基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)代謝的重編程。Sirt3缺失會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）增加從而使HIF-1a穩(wěn)定。在人的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)降低，這與HIF-1a的靶基因表達(dá)增多有關(guān)。最終，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3過(guò)表達(dá)會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的糖酵解和細(xì)胞增殖過(guò)程，為腫瘤抑制提供了一種代謝上的機(jī)制。</p><p><b>　　介

4、紹</b></p><p>　　Otto Warburg 在19世紀(jì)20年代首次提到腫瘤細(xì)胞在充足氧的環(huán)境下也會(huì)進(jìn)行糖酵解過(guò)程（Warburg,1956）。這種有氧下的糖酵解偏倚叫做Warburg效應(yīng)，被視為許多腫瘤中標(biāo)志性特征。這種效應(yīng)有利于理解葡萄糖攝入和代謝加強(qiáng)造成的細(xì)胞生存和繁殖潛能增加的通路，這已經(jīng)被廣泛的關(guān)注（Tennant et al., 2010; Vander Heiden et a

5、l., 2009）。越來(lái)越多的證據(jù)表明有氧糖酵解會(huì)支持腫瘤細(xì)胞的增殖。葡萄糖代謝的提高會(huì)有利于為核糖、氨基酸和脂質(zhì)合成提供原料，從而為提高了有氧糖酵解的腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)（Tong et al., 2009）。由于腫瘤血管化會(huì)導(dǎo)致間斷的低氧，所以持續(xù)的有氧糖酵解會(huì)提供給腫瘤細(xì)胞更大的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)（Gatenby and Gillies, 2004）。癌前損傷到浸潤(rùn)性癌的轉(zhuǎn)變過(guò)程常伴隨著葡萄糖攝入的增高這一現(xiàn)象也支持了本觀點(diǎn)。</p&

6、gt;<p>　　癌細(xì)胞的代謝重編程被數(shù)個(gè)致癌線索所調(diào)控，包括PI3K/Akt，Myc，或HIF通路，這些通路會(huì)使葡萄糖攝入、糖酵解、血管再生和抗逆性均上調(diào)（Kaelin and Ratcliffe, 2008; Semenza, 2010; Tennant et al., 2010;Tong et al., 2009）。最近發(fā)現(xiàn)，線粒體內(nèi)的酶的突變?cè)诩?xì)胞代謝轉(zhuǎn)變過(guò)程中表現(xiàn)出很重要的作用。例如，TCA循環(huán)中的酶發(fā)生獲得或失

7、去性突變會(huì)調(diào)節(jié)HIF-1a的活性并促進(jìn)致癌(Gottlieb and Tomlinson, 2005; Zhao et al., 2009)。相應(yīng)地，闡明線粒體內(nèi)的新的調(diào)節(jié)因子會(huì)為癌變細(xì)胞的代謝重編程提供重要的前景。</p><p>　　SIRT家族是保守的NAD依賴型ADP核糖轉(zhuǎn)移酶或與代謝過(guò)程，抗逆反應(yīng)和壽命相關(guān)的蛋白的去乙?；福‵inkel et al., 2009）。哺乳動(dòng)物體內(nèi)有7種，SIRT3-5位

8、于線粒體。在中心代謝中，sirt3 是一種關(guān)鍵的去乙?；?，調(diào)控氧的許多代謝通路（Verdin et al., 2010）。例如，sirt3 能使電子傳遞鏈中復(fù)合體I與復(fù)合體II去乙?；?。SIRT3也能去乙?；疞CAD導(dǎo)致禁食過(guò)程中肝細(xì)胞脂肪酸氧化（Hirschey et al., 2010）。SIRT3同樣會(huì)作用于線粒體內(nèi)的IDH2和MnSOD，打破細(xì)胞內(nèi)ROS 的穩(wěn)定。Sirt3缺失會(huì)導(dǎo)致ROS上升，引起許多老年性的病理特征，包括聽(tīng)

9、力喪失和腫瘤發(fā)生（Kim et al., 2010; Someya et al., 2010）。先前，SIRT3一直起腫瘤抑制的作用，通過(guò)減少ROS和維持基因穩(wěn)定（Kim et al.,2010）。在本次研究中，雖然SIRT3 敲除細(xì)胞也表現(xiàn)出葡萄糖攝入增加，線粒體氧化轉(zhuǎn)化，但是SIRT3在腫瘤發(fā)生中直接調(diào)節(jié)作用仍然是一個(gè)問(wèn)題。由于SIRT3在ROS調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，我們專門(mén)地證</p><p><b>

10、;　　結(jié)果</b></p><p>　　SIRT3促進(jìn)細(xì)胞的代謝重編程</p><p>　　因?yàn)镾IRT3能激活線粒體內(nèi)能量代謝的酶并且SIRT3確實(shí)還會(huì)增加糖的攝入，所以我們假設(shè)SIRT3在糖代謝通路和線粒體氧化代謝中起重要的調(diào)控作用從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。為了證明這個(gè)假設(shè)，我們?cè)谛∈笈咛コ衫w維細(xì)胞（MEFs）內(nèi)用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法檢測(cè)SIRT3缺失的影響。與SIRT3

11、 野生型（WT）相比較，SIRT3 KO MEFs 表現(xiàn)出一種明顯的朝向糖酵解的轉(zhuǎn)變（圖1A）。在SIRT3 KO細(xì)胞內(nèi)，糖酵解的產(chǎn)物提高，而TCA循環(huán)的產(chǎn)物下降。SIRT3 KO細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖下降這與所建立葡萄糖消耗增加模型相一致，然而糖酵解內(nèi)的一種產(chǎn)物葡萄糖-1-磷酸含量卻是增高的。葡萄糖-1-磷酸能被葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶催化生成葡萄糖-6-磷酸從而為糖酵解或能產(chǎn)生NADPH和核糖的磷酸戊糖途徑提供原料。非氧化的代謝途徑磷酸戊糖途徑能用

12、6-磷酸果糖或3-磷酸甘油酸生成5-磷酸核糖?？傊?，葡萄糖-6-磷酸，糖代謝的中間產(chǎn)物和5-磷酸核糖在SIRT3 KO細(xì)胞內(nèi)含量上升，表明糖代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)向磷酸戊糖途徑從而生成核酸。尤其，SIRT3確實(shí)導(dǎo)致的代謝體這種轉(zhuǎn)變與腫瘤周圍組織的代謝模型極為相似。</p><p>　　像許多腫瘤細(xì)胞一樣SIRT3 KO MEFs糖酵解和磷酸戊糖途徑的代謝產(chǎn)物增加可能是將葡萄糖離開(kāi)TCA循環(huán)轉(zhuǎn)向生物合成的細(xì)胞增殖。事實(shí)上，SI

13、RT3 KO 細(xì)胞明顯比WT細(xì)胞生長(zhǎng)快。為了檢測(cè)這種加快是不是需要有氧代謝，我們將細(xì)胞培養(yǎng)在含有半乳糖而不是葡萄糖的介質(zhì)中，從而減少糖酵解通量迫使細(xì)胞依賴氧化磷酸化。在這種條件下，WT與KO細(xì)胞速率基本一致，說(shuō)明KO細(xì)胞的增殖加快需要提高葡萄糖的代謝。</p><p><b>　　圖 1</b></p><p>　　為了證明這種代謝型反映了糖酵解的增加，我們檢測(cè)了葡萄

14、糖的攝入和乳糖的產(chǎn)量。如預(yù)測(cè)，SIRT3 KO MEFs消耗更多的葡萄糖并且產(chǎn)出更多地乳糖。不止是MEFs，在HEK293T細(xì)胞內(nèi)如果用慢病毒表達(dá)抗SIRT3的shRNA來(lái)減少SIRT3的表達(dá)，則293T細(xì)胞也會(huì)增加葡萄糖的攝入和乳糖的產(chǎn)生。很有趣的是SIRT3缺失對(duì)葡萄糖攝入和乳酸產(chǎn)生的影響與丙酮酸激酶M2型過(guò)表達(dá)或mTOR激活相類似。這些資料表明SIRT3更改細(xì)胞代謝有利于糖酵解，結(jié)果SIRT3水平低的細(xì)胞表現(xiàn)出與Warburg效

15、應(yīng)相類似的特征。</p><p>　　先前的研究發(fā)現(xiàn)SIRT3缺失會(huì)導(dǎo)致葡萄糖攝入增加，然而，據(jù)我們所知，具體的機(jī)制還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。為了驗(yàn)證SIRT3上調(diào)糖酵解是否是一種氧化能力減弱的代償性反應(yīng)，我們檢測(cè)了在線粒體呼吸抑制劑魚(yú)藤酮或線粒體脂肪酸氧化的抑制劑乙莫克舍作用下葡萄糖的攝入和乳酸的分泌。在WT細(xì)胞內(nèi)，糖酵解在魚(yú)藤酮和乙莫克舍作用下均提高。很明顯，在SIRT3KO細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝入和乳酸分泌在氧化抑制劑下仍保持

16、著提高。這些資料表明，SIRT3 KO細(xì)胞內(nèi)糖酵解的提升不是單單線粒體氧化損傷代償性所導(dǎo)致的。相反這些資料表明，SIRT3提高糖代謝可能是通過(guò)某條具體的信號(hào)通路。</p><p><b>　　圖 2</b></p><p>　　我們接下來(lái)探尋SIRT3KO是否掩蓋了葡萄糖消耗提高的跡象。我們給小鼠注射18F-FDG然后用PET/CT檢測(cè)葡萄糖攝入。我們特別地檢測(cè)BAT

17、，因?yàn)锽AT會(huì)抑制高度的糖攝入。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)SIRT3KO小鼠BAT的18F-FDG攝入相比于WT小鼠有所增加，即使SIRT3KO小鼠的BAT沒(méi)有WT的大。BAT的葡萄糖攝入是被β腎上腺素途徑調(diào)控的，因此會(huì)在寒冷條件下顯著上升。我們檢測(cè)18F-FDG在6小時(shí)冷凍處理后SIRT3 KO和WT的BAT內(nèi)的攝入，然后發(fā)現(xiàn)SIRT3KO鼠無(wú)論在室溫還是在4℃都會(huì)有更高的18F-FDG攝入，表明SIRT3WT和KO對(duì)β腎上腺素途徑調(diào)控的BAT葡萄

18、糖攝入有相似的增加。這些BAT葡萄糖攝入相對(duì)于整體的葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡單獨(dú)地具有明顯變化：我們沒(méi)有檢測(cè)血液內(nèi)的葡萄糖水平優(yōu)于先前有報(bào)道。</p><p>　　為檢測(cè)SIRT3KO的BAT葡萄糖攝入增加的機(jī)制，我們對(duì)BAT分離的RNA檢測(cè)了全基因組表達(dá)譜并用基因排序列表在GSEA上從上調(diào)最多到下調(diào)最多進(jìn)行排序從而明確SIRT3KO最顯著改變的代謝通路。因?yàn)镾IRT3是線粒體內(nèi)的去乙酰化酶，我們期望看到線粒體功能或能量產(chǎn)

19、生上的代謝通路的代償性上調(diào)。讓我們驚訝的是，SIRT3缺失會(huì)上調(diào)腫瘤發(fā)生中重要的通路。尤其是在SIRT3KO中的9個(gè)基因集顯著過(guò)表達(dá)，三個(gè)是只受缺氧誘導(dǎo)的。缺氧本身會(huì)增加18F-FDG的攝入并且與許多轉(zhuǎn)錄改變有關(guān)，這些改變會(huì)導(dǎo)致葡萄糖攝入和利用增加。因此我們假設(shè)SIRT3KO的糖攝入增加可以用缺氧反應(yīng)的上調(diào)來(lái)解釋。</p><p>　　SIRT3KO與缺氧細(xì)胞的基因特征極其相似，因?yàn)槿毖鯐?huì)誘導(dǎo)與SIRT3缺失相似

20、的代謝轉(zhuǎn)換，包括線粒體氧化產(chǎn)物的減少和糖酵解的增加。為了檢測(cè)SIRT3在低氧誘導(dǎo)的代謝重編程中所起的作用，我們分析了從培養(yǎng)在21%和1%O212小時(shí)的MEFs中提取的代謝產(chǎn)物。我們發(fā)現(xiàn)缺氧與SIRT3缺失所導(dǎo)致的糖酵解中間產(chǎn)物的增加現(xiàn)象相似。甚至，缺氧和SIRT3缺失有額外效應(yīng)：雖然糖酵解，肝糖分解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物上升，但在同樣的條件下，SIRT3KOMEFs表現(xiàn)出更高的水平。與代謝輪廓相一致，低氧會(huì)在兩種細(xì)胞系能都導(dǎo)致糖攝入增

21、加，但SIRT3KO的細(xì)胞增加的量更多?？傊?，這些資料表明SIRT3缺失和低氧會(huì)導(dǎo)致相似的代謝轉(zhuǎn)型，也說(shuō)明了低氧通路的不正常激活是SIRT3缺失導(dǎo)致代謝重編程的一種誘因。</p><p>　　SIRT3 通過(guò)使HIF1α不穩(wěn)定抑制Warburg效應(yīng)</p><p>　　HIF1，HIF1α和HIF1β的異質(zhì)二聚體，是在缺氧過(guò)程中導(dǎo)致糖酵解和乳酸產(chǎn)量增加的一個(gè)重要的起子。在低氧條件下，HIF

22、1α被穩(wěn)定并促進(jìn)許多與低氧反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)。結(jié)果，在低氧下缺少HIF1α的細(xì)胞不能上調(diào)糖酵解中的酶和乳酸產(chǎn)量?？紤]到體內(nèi)低氧的SIRT3KO BAT的基因標(biāo)記，除了SIRT3KOMEFs和缺氧細(xì)胞的線粒體內(nèi)糖分解的相似性，我們解釋這個(gè)機(jī)制通過(guò)HIF1α。為了檢測(cè)這個(gè)觀點(diǎn)，我們首先檢測(cè)SIRT3是否直接調(diào)節(jié)HIF1α在正常氧環(huán)境下。在較高氧環(huán)境下，HIF1α?xí)芸旖到獠⑶译y以從提取物中檢測(cè)，但是HIF1α可以從細(xì)胞核的提取物中檢測(cè)。事實(shí)

23、上，從SIRT3受損細(xì)胞內(nèi)提取的細(xì)胞核表明相對(duì)于WT細(xì)胞，有更高的HIF1α水平。同樣地，當(dāng)MEFs培養(yǎng)在1%O2時(shí)HIF1α在SIRT3KO細(xì)胞內(nèi)會(huì)穩(wěn)定更早而且含量更高相比于WT細(xì)胞。在HEK293T細(xì)胞內(nèi)用慢病毒的shRNA干擾SIRT3后也得到了類似的SIRT3 表達(dá)減少的結(jié)論。重要的是SIRT3同樣調(diào)控HIF1α目標(biāo)基因的表達(dá)。在腫瘤發(fā)生中HIF1α目標(biāo)基因——葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Glut1和己糖激酶HK2都緊密地涉及在內(nèi)，這些基因?qū)?

24、lt;/p><p><b>　　圖 3</b></p><p>　　為了檢測(cè)SIRT3是否直接抑制HIF1α，我們檢測(cè)了在SIRT3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)HIF1α和其目標(biāo)基因的水平。SIRT3過(guò)表達(dá)明顯并且可復(fù)得減少了在低氧下HIF1α的穩(wěn)定性。重要的是，在低氧下，SIRT3過(guò)表達(dá)使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT1和HK2在低氧下的誘導(dǎo)減弱了，說(shuō)明SIRT3直接抑制了HIF1α的功能。

25、完全地抑制HIF1α 目標(biāo)基因需要SIRT3的催化活性：SIRT3催化的表達(dá)突變并不會(huì)明顯地減少低氧下GLUT1的表達(dá)。此外，我們用原始MEFs發(fā)現(xiàn)兩株SIRT3KO細(xì)胞抑制了GLUT1的表達(dá)，表明SIRT3能在原始細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)HIF1α的表達(dá)。歸納來(lái)看，這些資料顯示SIRT3控制HIF1α的穩(wěn)定和HIF1α與有氧糖消耗有關(guān)的目標(biāo)基因的誘發(fā)。</p><p>　　然后，為了檢驗(yàn)HIF1α在SIRT3 敲除細(xì)胞內(nèi)所觀

26、察到的糖酵解的類型轉(zhuǎn)變的作用，我們用兩種不同的shRNA對(duì)HIF1α進(jìn)行敲除來(lái)創(chuàng)造SIRT3WT和KO的MEFs，并且HIF1α平穩(wěn)減少。我們檢測(cè)正常氧和低氧下GLUT1在這些細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，如所預(yù)期那般，對(duì)照組（shNS）SIRT3KO MEFs表現(xiàn)出一種對(duì)于低氧的過(guò)度反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)GLUT1的表達(dá)倍數(shù)變化可以看出。相反，用抗HIF1α的shRNA處理的WT和SIRT3KO MEFs具有相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)對(duì)于低氧。重要的是，SIRT3敲除

27、導(dǎo)致的乳酸產(chǎn)量上升無(wú)論在正常氧還是低氧下都需要HIF1α?？傊@些資料表明SIRT3通過(guò)HIF1α調(diào)節(jié)有氧的糖分解。</p><p>　　為了證明體內(nèi)HIF1α活性增加，我們檢測(cè)了來(lái)自SIRT3WT和KO鼠的組織內(nèi)HIF1α和HIF1α目標(biāo)基因的水平。與糖分解有關(guān)的HIF1α目標(biāo)基因和HIF1α蛋白在SIRT3 KO鼠的BAT內(nèi)都有顯著增加，這與我們的研究一致。相類似的是數(shù)個(gè)HIF1α目標(biāo)基因在SIRT3KO心

28、臟內(nèi)也有增加的趨勢(shì)。</p><p>　　HIF1α的調(diào)節(jié)是極其復(fù)雜的而且還未完全明白。在正常氧下，HIF1α在兩個(gè)脯氨酸殘基位點(diǎn)被PHD1-3羥化，使vHL能結(jié)合到HIF1α上使其泛素化并被蛋白酶體降解。因?yàn)槲覀儾](méi)有檢測(cè)HIF1αmRNA水平的變化，我們檢測(cè)了是否SIRT3發(fā)揮一種轉(zhuǎn)錄后的影響對(duì)于HIF1α的穩(wěn)定性。SIRT1結(jié)合HIF1α 調(diào)節(jié)其活性通過(guò)直接去乙?；?。為了檢測(cè)SIRT3是否有相似的機(jī)制，我們

29、使用免疫沉淀探尋SIRT3與SIRT1對(duì)HIF1α的作用。SIRT1下調(diào)了HIF1α但是SIRT3沒(méi)有，說(shuō)明SIRT3沒(méi)有直接與HIF1α作用。</p><p>　　我們?nèi)缓髾z測(cè)另一個(gè)假說(shuō)——SIRT3調(diào)節(jié)HIF1α通過(guò)修飾PHD活性通過(guò)檢測(cè)HIF1α的羥化水平。我們?cè)u(píng)估對(duì)照組和SIRT3KO HEK293T的PHD活性通過(guò)用蛋白酶體抑制劑MG-132（抑制HIF1α羥化防止被降解）或DMOG（一致PHDs）處理

30、細(xì)胞。盡管SIRT3 敲除細(xì)胞堆積了更多的HIF1α在MG-132處理時(shí)，但他們的被羥化HIF1α卻顯著減少，說(shuō)明PHD活性在SIRT3敲除組更低。相類似，SIRT3 WT MEFs表現(xiàn)出更高的HIF1α羥化水平。如果SIRT3通過(guò)修飾PHD影響HIF1α穩(wěn)定性，難么用DMOG處理會(huì)使SIRT3 KO和WT具有相等的HIF1α穩(wěn)定。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)在每次檢測(cè)時(shí)SIRT3 WT和KO 有相等的HIF1α穩(wěn)定性在被DMOG處理過(guò)后。<

31、/p><p>　　為了證實(shí)SIRT3影響HIF1α通過(guò)PHD，我們實(shí)施了一系列的實(shí)驗(yàn)比較低氧和DMOG對(duì)SIRT3 KO和WT MEFs的影響。我們觀察到，低氧和DMOG都能使HIF1α穩(wěn)定并誘導(dǎo)HIF1α名目標(biāo)基因表達(dá)。SIRT3 WT 和KO MEFs對(duì)低氧和DMOG的相關(guān)反應(yīng)強(qiáng)調(diào)了PHDs是SIRT3 調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。在低氧下，HIF1α目標(biāo)基因會(huì)被SIRT3 KO更加強(qiáng)烈的誘導(dǎo)，表明了SIRT3 在調(diào)節(jié)低氧代謝上

32、的重要的生理作用。相反SIRT3敲除會(huì)抑制DMOG導(dǎo)致的HIF1α目標(biāo)基因的誘發(fā)。這些資料支持一種模型——PHD的活性已經(jīng)被SIRT3 敲除所抑制。結(jié)果，當(dāng)PHD活性被DMOG所抑制時(shí)，SIRT3 會(huì)有一個(gè)相似的效應(yīng)，所以HIF1α目標(biāo)基因會(huì)有更小的誘發(fā)?？傊@些結(jié)果指明SIRT3會(huì)通過(guò)減弱PHD活性來(lái)增加HIF1α表達(dá)。</p><p>　　除了氧濃度之外，已知的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)PHD活性的信號(hào)還有好幾個(gè)。最值得注

33、意的是ROS會(huì)抑制PHD并使HIF1α穩(wěn)定。甚至，缺氧會(huì)觸發(fā)ROS在細(xì)胞內(nèi)的增加，這是低氧下HIF1α激活所必須的。因?yàn)镾IRT3是有名的一種ROS抑制劑，我們假設(shè)SIRT3缺陷的細(xì)胞內(nèi)ROS增多會(huì)導(dǎo)致PHDs被抑制。因此，我們檢測(cè)SIRT3丟失是否會(huì)放大低氧下的ROS增加。我們發(fā)現(xiàn)在SIRT3 KO MEFs中低氧導(dǎo)致的ROS顯著增加，提供了一種機(jī)制上的解釋——為什么SIRT3 敲除細(xì)胞會(huì)放大低氧效應(yīng)。</p><

34、p><b>　　圖 4</b></p><p>　　然后，我們用抗氧化劑NAC處理細(xì)胞來(lái)證明一種模型——抑制ROS會(huì)阻礙SIRT3 敲除的效應(yīng)。事實(shí)上，我們觀察到盡管SIRT3 KO MEFs有更高的HIF1α在低氧下，但NAC處理會(huì)使HIF1α降到與SIRT3 WT相當(dāng)?shù)乃?。相反，SIRT3 KO和WT MEFs在DMOG下有相當(dāng)?shù)乃降贒MOG下用NAC處理不再使HIF1α不穩(wěn)

35、定。如預(yù)料的那樣，NAC處理的KO MEFs內(nèi)HIF1α下降，NAC處理能修復(fù)GLUT1在SIRT3 KO MEFs細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。最終，為檢測(cè)ROS增加是否是SIRT3 KO MEFs大量增殖的原因，我們用NAC處理細(xì)胞并檢測(cè)生長(zhǎng)速率。我們發(fā)現(xiàn)，SIRT3 KO MEFs增殖速率恢復(fù)到WT類型的水平。因此，SIRT3 調(diào)節(jié)ROS在HIF1α穩(wěn)定和糖代謝激活方面起著重要的作用。</p><p>　　為了檢測(cè)RO

36、S在體內(nèi)改變BAT代謝的作用，我們首先尋找在SIRT3 KO組織內(nèi)的ROS增加的證據(jù)。我們發(fā)現(xiàn)兩種氧化損傷——蛋白羰基和脂質(zhì)過(guò)氧化，在SIRT3 KO BAT內(nèi)明顯提升。因?yàn)榭寡趸幚頃?huì)挽救HIF1α誘發(fā)的基因表達(dá)，我們假設(shè)NAC處理會(huì)抑制SIRT3 KO 組織內(nèi)的糖分解特征。為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們用NAC飼養(yǎng)小鼠一個(gè)月，然后測(cè)試HIF1α目標(biāo)基因的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)NAC會(huì)抑制SIRT3 KO小鼠內(nèi)HIF1α目標(biāo)基因的表達(dá)，但WT 內(nèi)則

37、不會(huì)。這些資料表明，ROS產(chǎn)量上升在SIRT3缺失小鼠體內(nèi)會(huì)提高糖分解基因的表達(dá)。</p><p>　　SIRT3 缺失會(huì)加強(qiáng)糖酵解特征</p><p>　　HIF1α活性和有氧糖酵解在Warburg 效應(yīng)里很明顯，所以我們?cè)O(shè)想SIRT3 可能是通過(guò)抑制Warburg效應(yīng)的HIF1α調(diào)節(jié)活性發(fā)揮他的腫瘤抑制作用。SIRT3 敲除會(huì)增加克隆形成在軟瓊脂群落生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)內(nèi)。為檢測(cè)HIF1α在腫瘤發(fā)

38、生中的作用，我們用Ras和E1a致癌基因誘導(dǎo)原始MEFs，然后敲除HIF1α。如前面所示，我們發(fā)現(xiàn)SIRT3 缺失會(huì)增加克隆形成。重要的是HIF1α敲除會(huì)抑制SIRT3 KO細(xì)胞的克隆形成。更重要的是SIRT3 WT與KO MEFs以相同的速率形成克隆當(dāng)培養(yǎng)在含有半乳糖的介質(zhì)中， 這表明克隆形成需要糖代謝?？傊@些資料表明SIRT3 通過(guò)HIF1α導(dǎo)致的代謝重編程可能是SIRT3 起腫瘤抑制作用的一個(gè)重要的因素。接下來(lái)，我們進(jìn)行了異種

39、移植實(shí)驗(yàn)使用轉(zhuǎn)型后的MEFs為了觀察SIRT3 敲除后的腫瘤代謝狀態(tài)。如先前研究所示，我們發(fā)現(xiàn)缺少SIRT3的腫瘤有更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)：KO型內(nèi)64%形成腫瘤，而WT型內(nèi)只有27%。并且缺少SIRT3 的腫瘤生長(zhǎng)更快而且更大。因?yàn)槟[瘤受間斷性低氧支配，我們檢測(cè)了在異種移植內(nèi)糖酵解限速酶的表達(dá)。HIF1α的目的基因在SIRT3 K</p><p>　　SIRT3 在很多腫瘤內(nèi)缺失</p><p>

40、;　　我們的資料顯示，SIRT3 可能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝通路。為了證明SIRT3 在腫瘤內(nèi)的聯(lián)系，我們首先檢測(cè)了SIRT3 復(fù)制數(shù)的變化，這與腫瘤的發(fā)展程度有關(guān)。在20%的腫瘤內(nèi)至少一份SIRT3缺失而在乳腺癌內(nèi)這個(gè)數(shù)據(jù)有40%。在所有腫瘤中SIRT3被局灶性的刪除了（少于一條染色體筆），并且在腫瘤和卵巢腫瘤內(nèi)局灶性刪除更加明顯。相反，SIRT4和SIRT5在上訴14種類型中細(xì)胞內(nèi)并沒(méi)有明顯的減少。TP53是一種腫瘤抑制劑在許多人類癌癥

41、中缺失，因此可以作為一種控制。我們對(duì)SIRT3復(fù)制數(shù)的分析顯示這14種細(xì)胞并沒(méi)有明顯增多。大多數(shù)SIRT3缺失是雜合的，并且SIRT3缺失頻率與眾所周知的腫瘤抑制劑——BRCA1和BRCA2相似，他們?cè)谌祟惾橄侔┲蟹謩e是43%和40%的雜合率。有趣的是缺失最多的基因包括SIRT3并不包含任何腫瘤抑制劑。</p><p>　　因?yàn)槿橄侔┍磉_(dá)出極高的SIRT3缺失與其他的腫瘤相比，我們進(jìn)一步在人類乳腺癌中檢查SIRT

42、3。提高的HIF1α表達(dá)在乳腺癌中與腫瘤的侵略性和預(yù)后有關(guān)。許多乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出糖酵解增加和GLUT1的表達(dá)增加，這是許多乳腺癌的活體特征。在異體移植模型中，SIRT3缺失增加HIF1α目標(biāo)基因的表達(dá)，也會(huì)加劇GLUT1表達(dá)。因此，我們尋找SIRT3缺失和HIF1α目標(biāo)基因的關(guān)系在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)。7種正常乳細(xì)胞和40乳腺導(dǎo)管癌的基因表達(dá)圖譜表明SIRT3表達(dá)明顯下降在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)。此外，數(shù)個(gè)HIF1α目標(biāo)基因——尤其是GLUT1，明顯表達(dá)

43、提升。我們進(jìn)一步分析SIRT3和GLUT1的相應(yīng)關(guān)系在單個(gè)樣例中，發(fā)現(xiàn)SIRT3明顯與GLUT1負(fù)相關(guān)（p=0.0008）。我們的結(jié)果表明SIRT3的缺失與增加的HIF1α目標(biāo)基因的表達(dá)有關(guān)，這提供了一種SIRT3缺失與腫瘤在代謝上的一種關(guān)聯(lián)機(jī)制。</p><p>　　為證明SIRT3在人乳腺癌中表達(dá)減少，我們分析了SIRT3的蛋白水平使用免疫組化在正常的乳上皮除了一大區(qū)域的人乳腺癌組織。在46病人樣例中，只有6

44、個(gè)表現(xiàn)出與正常上皮一個(gè)樣的SIRT3表達(dá)。很明顯，87%的病人表現(xiàn)出減少的或者不可檢測(cè)的SIRT3印跡在相鄰的癌組織中，20%的病人表現(xiàn)出沒(méi)有SIRT3。相似地，人乳腺癌樣本的一個(gè)單獨(dú)基因表達(dá)圖譜顯示25%的乳腺癌的Sirt 3的mRNA減少了至少6倍，相比于正常的乳上皮細(xì)胞。這個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)提供了額外的證據(jù)，用來(lái)支持我們所觀察到的SIRT3在人腫瘤中減少的這一現(xiàn)象。此外，一個(gè)早期的171例人乳腺癌的高分辨度分析顯示SIRT3是明顯減少的

45、。Kim報(bào)道的SIRT3 KO小鼠產(chǎn)生了腫瘤和人乳腺癌腫瘤內(nèi)SIRT3明顯降低也是支持改發(fā)現(xiàn)的。</p><p>　　對(duì)于SIRT3在人乳腺癌內(nèi)的表達(dá)研究表明SIRT3可能起到一種腫瘤抑制的作用，通過(guò)阻止代謝向有利于腫瘤生長(zhǎng)的方向轉(zhuǎn)型來(lái)起作用。為了檢查SIRT3是否能抑制Warburg效應(yīng)，我們?cè)贛CF7、T47D和CAMA1這三種細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)SIRT3。我們分析了葡萄糖攝入和乳酸的分泌在低氧下從而模擬腫瘤的微環(huán)

46、境。我們發(fā)現(xiàn)SIRT3抑制乳酸產(chǎn)生和葡萄糖攝入在所有細(xì)胞系。這些數(shù)據(jù)表明SIRT3過(guò)表達(dá)會(huì)抑制與Warburg效應(yīng)有關(guān)的代謝轉(zhuǎn)變。因?yàn)镾IRT3強(qiáng)烈抑制CAMA1的葡萄糖攝入和乳酸產(chǎn)生，我們選擇深入分析這些細(xì)胞。為了檢測(cè)復(fù)合體I或脂肪酸氧化對(duì)這些表現(xiàn)型的影響，我們測(cè)量了魚(yú)藤酮與乙莫克舍存在下葡萄糖攝入和乳酸產(chǎn)生。魚(yú)藤酮與乙莫克舍都增加對(duì)照組與SIRT3過(guò)表達(dá)組葡萄糖攝入和乳酸產(chǎn)生到一種相似的程度，表明SIRT3抑制糖酵解是依賴SIRT3

47、對(duì)脂肪酸氧化或復(fù)合體I的作用的。</p><p><b>　　圖 5</b></p><p>　　我們?nèi)缓髾z測(cè)是否SIRT3抑制CAMA1的HIF1α。SIRT3過(guò)表達(dá)在低氧下強(qiáng)烈降低HIF1α蛋白水平和HIF1α目標(biāo)基因。甚至，當(dāng)我們檢測(cè)低氧或DMOG下HIF1α目標(biāo)基因倍數(shù)變化時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與SIRT3 KO MEFs相反的結(jié)果。當(dāng)用DMOG處理時(shí)，SIRT3過(guò)表達(dá)

48、鈍化低氧效應(yīng)。SIRT3過(guò)表達(dá)細(xì)胞提高PHD活性的模型與此一致，表明SIRT3在PHD方面調(diào)節(jié)低氧生理現(xiàn)象的重要性。</p><p>　　然后，我們檢測(cè)此前的一個(gè)假說(shuō)，SIRT3調(diào)節(jié)葡萄糖代謝影響癌細(xì)胞增殖。SIRT3過(guò)表達(dá)顯著抑制培養(yǎng)在高糖的CAMA1細(xì)胞增殖。而在只含半乳糖的介質(zhì)中對(duì)照組和SIRT3過(guò)表達(dá)組增殖速率相似。該數(shù)據(jù)表明，SIRT3調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長(zhǎng)痛過(guò)影響葡萄糖的代謝過(guò)程。</p>&l

49、t;p><b>　　討論</b></p><p>　　在本研究中，我們表明SIRT3通過(guò)HIF1α調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有重要意義。重要的是，SIRT3是線粒體的去乙?；?，它能夠激活很多代謝酶，促進(jìn)線粒體底物氧化和ATP產(chǎn)生。我們研究表明SIRT3通過(guò)調(diào)節(jié)HIF1α的穩(wěn)定性和活性控制糖酵解。我們發(fā)現(xiàn)在SIRT3敲除的細(xì)胞內(nèi)提高的ROS有助于增加HIF1α的穩(wěn)定性和活性。人腫瘤樣本中S

50、IRT3缺失與糖酵解基因表達(dá)對(duì)應(yīng)關(guān)系表明了SIRT3介導(dǎo)的代謝重編程的重要性。該觀點(diǎn)被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)的SIRT3抑制Warburg效應(yīng)所確認(rèn)?？傊@些數(shù)據(jù)提供了一種SIRT3作為一個(gè)腫瘤抑制劑調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)糖代謝的機(jī)制。我們的發(fā)現(xiàn)與先前的工作相一致，表明SIRT3通過(guò)調(diào)節(jié)ROS起到腫瘤抑制的作用。Kim發(fā)現(xiàn)在SIRT3缺失的細(xì)胞內(nèi)，ROS提高會(huì)增加基因的不穩(wěn)定性，提供一種腫瘤易生的環(huán)境。我們認(rèn)為SIRT3缺失和ROS提高會(huì)通過(guò)改變細(xì)胞的代謝環(huán)境

51、從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。在該研究中我們發(fā)現(xiàn)提高的ROS會(huì)使HIF1α穩(wěn)定，增加葡萄糖攝入和代謝，從而提供增殖所需的能量。重要的是我們說(shuō)明了增加的糖酵解不單單是線粒體氧化降低的代償性反應(yīng)。相反，SIRT3能夠通過(guò)激活一系列信號(hào)通路調(diào)</p><p>　　最近的研究集中于SIRT3調(diào)節(jié)ROS的機(jī)制。一些團(tuán)隊(duì)提供證據(jù)表明SIRT3能通過(guò)Foxo3a影響抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，盡管我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Sod2的表達(dá)差異。此外，SIRT3能

52、作用于IDH2影響氧化還原作用，作用于SOD2激活線粒體ROS清除。結(jié)果，SIRT3能直接通過(guò)去乙?；绊懢€粒體代謝和ROS產(chǎn)生。同時(shí)，SIRT3活性減少導(dǎo)致的ROS副產(chǎn)物會(huì)起一種退化信號(hào)的作用，來(lái)重編程細(xì)胞代謝。</p><p>　　我們研究揭示了SIRT3對(duì)于糖酵解和腫瘤細(xì)胞代謝的深遠(yuǎn)影響。SIRT3在腫瘤細(xì)胞內(nèi)明顯減少。這對(duì)于未來(lái)的檢測(cè)SIRT3對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的作用是至關(guān)重要的?？紤]到SIRT3在乳癌中的作

53、用，除了我們SIRT3重編程細(xì)胞代謝的發(fā)現(xiàn)，我們建議細(xì)胞內(nèi)缺少SIRT3會(huì)向腫瘤發(fā)生的方向轉(zhuǎn)變，尤其是乳癌中。為支持該觀點(diǎn)，我們顯示SIRT3在三種獨(dú)立乳腺癌細(xì)胞內(nèi)能直接抑制Warburg效應(yīng)?？傊覀兊难芯筷U明了SIRT3作為腫瘤抑制劑的功能，一部分是通過(guò)HIF1α調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。這些發(fā)現(xiàn)表明SIRT3對(duì)腫瘤的調(diào)節(jié)能為腫瘤的診斷和治療提供一個(gè)重要的領(lǐng)域。</p><p><b>　　圖 6</b