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文檔簡介
1、草菇(Volvariella volvacea)是產(chǎn)于熱帶和亞熱帶高溫潮濕地區(qū)的一種腐生真菌,具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值。但是草菇不耐低溫冷藏,即使在常規(guī)低溫4℃條件下,菌絲也會(huì)迅速自溶,子實(shí)體會(huì)軟化、液化甚至腐爛。因此從分子水平探討草菇低溫自溶機(jī)制,并對其耐寒機(jī)制加以遺傳改造,可以為草菇低溫保鮮,低溫栽培以及菌種低溫保藏提供理論依據(jù)。
草菇的全基因組測序工作已經(jīng)完成,以前對草菇低溫誘導(dǎo)基因的篩選用的是差異顯示技術(shù),這種技術(shù)
2、只能分離到有限的差異基因片段。本實(shí)驗(yàn)利用數(shù)字基因表達(dá)譜測序技術(shù)制備草菇V23菌株和低溫誘變株VH3在0℃處理0、2、4小時(shí)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)技術(shù)對表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析:1高表達(dá)基因在菌株內(nèi)兩兩比較分析;2差異表達(dá)基因涉及的代謝途徑分析;3冷誘導(dǎo)相關(guān)代謝途徑中相關(guān)基因表達(dá)量分析;4結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)對相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)量測定分析。結(jié)果顯示:
1.在V23和VH3菌株處理組之間選取了前50個(gè)高表達(dá)
3、基因,進(jìn)行兩兩比較分析,在低溫處理組中的高表達(dá)基因大部分也同時(shí)出現(xiàn)在對照組中,33和34個(gè)基因同時(shí)分別出現(xiàn)在V23和VH3菌株對照組和低溫處理組中,我們認(rèn)為這些基因是與草菇菌絲維持正常生理功能有關(guān)的,而受低溫誘導(dǎo)的影響不大。
2.當(dāng)對照組與低溫處理組拷貝數(shù)之間比值大于等于15其P<0.01時(shí),我們把這類基因規(guī)定為差異表達(dá)基因。在V23菌株差異表達(dá)基因中,發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與抗性有關(guān)的基因,其中有一個(gè)與冷誘導(dǎo)有關(guān)涉及磷脂合成代謝途徑
4、。在VH3菌株中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與抗性有關(guān)的基因,其中有三個(gè)與冷誘導(dǎo)有關(guān)涉及糖原、海藻糖和甘露醇的合成降解途徑。
3.我們對兩個(gè)菌株磷脂合成的相關(guān)基因表達(dá)量變化分析,發(fā)現(xiàn)VH3菌株磷脂合成的相關(guān)基因表達(dá)量大部分都上調(diào),而V23菌株這些基因的表達(dá)量下調(diào),磷脂是細(xì)胞膜上的重要成分,低溫處理后誘導(dǎo)了細(xì)胞膜上的磷脂合成,VH3菌株在低溫誘導(dǎo)后膜上磷脂合成代謝旺盛,提高了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,而V23菌株沒有做出相應(yīng)的變化導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性發(fā)生變
5、化而自溶死亡。
4.我們對兩個(gè)菌株糖原和海藻糖合成降解途徑中相關(guān)基因表達(dá)量變化分析,V23菌株和VH3菌株糖原和海藻糖合成相關(guān)的基因表達(dá)量上升,而VH3菌株表達(dá)量上升的幅度更大,但是V23菌株糖原和海藻糖降解的相關(guān)基因表達(dá)量也同時(shí)上調(diào),恰好與VH3菌株相反,VH3菌株通過糖原和海藻糖等小分子糖類的合成,合成更多的糖原和海藻糖來抵御低溫脅迫,表現(xiàn)出了其耐低溫的特性。
5.我們對上面三個(gè)途徑中的三個(gè)關(guān)鍵基因結(jié)合熒
6、光定量PCR技術(shù)進(jìn)行表達(dá)量測定分析,基本和表達(dá)譜數(shù)據(jù)一致,驗(yàn)證了表達(dá)譜的可信性同時(shí)數(shù)據(jù)顯示VH3菌株表現(xiàn)出耐低溫的優(yōu)良特性。
6.我們對不飽和脂肪酸代謝途徑中兩個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)量測定,結(jié)果顯示兩個(gè)菌株在低溫刺激后,兩個(gè)基因表達(dá)量都下降了,但是VH3菌株下降的幅度要小于V23菌株,說明草菇在低溫刺激后不飽和脂肪酸合成的能力下降了,這可能和草菇不耐低溫有關(guān)。
通過對草菇低溫表達(dá)譜的制備和數(shù)據(jù)分析,推測相關(guān)代謝途徑與
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