家蠶脂肪體特異啟動(dòng)子BmLSP、BmLP3的克隆、鑒定及應(yīng)用.pdf

1、家蠶是重要經(jīng)濟(jì)文化昆蟲、鱗翅目模式昆蟲和理想的昆蟲“生物工廠”。自2003年家蠶全基因組序列測(cè)定以來,國(guó)內(nèi)外圍繞蠶絲蛋白合成、變態(tài)發(fā)育和分子免疫等家蠶重要經(jīng)濟(jì)及生物學(xué)性狀,迅即展開全面深入的基因鑒定與功能研究并取得了重要進(jìn)展,尤其針對(duì)蠶的生長(zhǎng)發(fā)育和變態(tài)這一昆蟲重大科學(xué)問題,已取得了包括基因和蛋白質(zhì)鑒定、重要基因的功能驗(yàn)證以及性狀形成機(jī)理的初步解析等豐富成果,為徹底闡釋蠶的生長(zhǎng)發(fā)育與變態(tài)機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 脂肪體是蠶的營(yíng)養(yǎng)

2、與能量?jī)?chǔ)存及供給中心,是體內(nèi)激素(如蛻皮激素和保幼激素等)作用的靶組織,在蠶的生長(zhǎng)發(fā)育和變態(tài)過程中扮演著關(guān)鍵角色。目前認(rèn)為,昆蟲的蛻皮與變態(tài)發(fā)育進(jìn)程受蛻皮激素控制,昆蟲發(fā)育的方向則受保幼激素調(diào)控。在家蠶中已經(jīng)發(fā)現(xiàn),許多在家蠶脂肪體特異表達(dá)的基因均在轉(zhuǎn)錄水平受到激素的精確調(diào)控,隨蠶的發(fā)育呈規(guī)律性的表達(dá)變化。因而,研究家蠶脂肪體表達(dá)基因及其功能與調(diào)控,對(duì)于闡釋昆蟲(家蠶)受激素調(diào)控的生長(zhǎng)發(fā)育與變態(tài)分子機(jī)理具有重要意義。不僅如此,蠶的脂肪體非

3、常發(fā)達(dá),特別在5齡幼蟲中后期至化蛹這段時(shí)間內(nèi),脂肪體約占體重的30％。按一頭蠶(5齡盛食期)平均體重為5g計(jì)算,其脂肪體蛋白含量最高可達(dá)到1.5g左右,如利用其生產(chǎn)外源蛋白,有望成為繼絲腺之后又一具重大開發(fā)潛力的新型昆蟲生物反應(yīng)器。
　　 盡管有關(guān)家蠶脂肪體及相關(guān)基因的研究已取得豐富積累,但總的來看,目前尚待解決的問題還很多。特別是脂肪體表達(dá)基因啟動(dòng)子的鑒定與功能研究,至今仍鮮有涉及,這也在一定程度上制約了相關(guān)基因的功能與調(diào)控機(jī)

4、理研究。為此,本文以家蠶脂肪體特異表達(dá)基因BmLSP(1-4齡幼蟲期特異表達(dá))和BmLP3(5齡幼蟲后期至化蛹階段特異表達(dá))為目標(biāo),在克隆該兩個(gè)啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上,以BmLP3啟動(dòng)子為重點(diǎn),首先,在細(xì)胞水平對(duì)BmLP3啟動(dòng)子的核心元件進(jìn)行鑒定與功能分析;其次,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在個(gè)體水平分別對(duì)BmLP3和BmLSP啟動(dòng)子進(jìn)行活性和特異性檢測(cè);第三,探索利用BmLP3啟動(dòng)子開發(fā)家蠶脂肪體生物反應(yīng)器。
　　 獲得的主要結(jié)果如下:
　　

5、 1 BmLSP和BmLP3啟動(dòng)子的生物信息學(xué)鑒定與克隆
　　 基于家蠶全基因組序列和基因芯片數(shù)據(jù),鑒定并克隆了BmLSP和BmLP3啟動(dòng)子序列:1)BmLSP啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度為1660 bp,含有BmLSP基因的第1外顯子、第1內(nèi)含子、核心啟動(dòng)區(qū)域和5'旁側(cè)區(qū),與家蠶品種蘇菊×明虎的LSP啟動(dòng)子區(qū)相比,在第1內(nèi)含子區(qū)的+341位置插入了一個(gè)263 bp的mariner-like轉(zhuǎn)座子序列,BmLSP啟動(dòng)子區(qū)存在與果蠅HSP23

6、蛻皮激素應(yīng)答元件和脂肪體特異轉(zhuǎn)錄基序高度同源的調(diào)控序列;2)BmLP3啟動(dòng)子序列長(zhǎng)度1119bp,該序列含有BmLP3基因的第1外顯子、第1內(nèi)含子、第2外顯子的一部分、核心啟動(dòng)區(qū)域和5'旁側(cè)區(qū),是未曾報(bào)道的序列。該序列存在典型的TATA框、一個(gè)Sp1蛋白結(jié)合的共有序列、一個(gè)Bm1元件等,暗示這些序列在BmLP3基因的表達(dá)中可能作為順式作用元件發(fā)揮其調(diào)控作用。
　　 2 BmLSP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DsRed在轉(zhuǎn)基因家蠶中的表達(dá)分析

7、>　　 家蠶幼蟲血清蛋白(larval serum protein,BmLSP)是由脂肪體細(xì)胞合成的一種貯藏蛋白,是研究家蠶幼蟲期發(fā)育調(diào)控的理想靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以piggyBac轉(zhuǎn)座子為介導(dǎo),通過轉(zhuǎn)基因的方法研究了BmLSP啟動(dòng)子在個(gè)體水平的活性及特異性。
　　 以攜帶有3xP3-EGFP熒光篩選標(biāo)記的piggyBac骨架載體為基礎(chǔ),紅色熒光蛋白DsRed為報(bào)告基因,構(gòu)建成pBac[BmLSP-DsRed-SV40]表達(dá)載體并顯微

8、注射家蠶P50早期胚胎,獲得了轉(zhuǎn)基因品系。分子檢測(cè)結(jié)果表明:BmLSP-DsRed表達(dá)框以單拷貝形式整合至家蠶基因組;DsRed在轉(zhuǎn)基因家蠶脂肪體中特異轉(zhuǎn)錄表達(dá),其時(shí)期表達(dá)特征與BmLSP基因基本一致,隨發(fā)育階段的不同呈現(xiàn)有規(guī)律的變化,即幼蟲期表達(dá),但1齡、2齡眠期不表達(dá),3齡、4齡眠期有微弱表達(dá),上蔟后表達(dá)量逐漸降低直至化蛾階段消失。提示BmLSP可能通過其啟動(dòng)子區(qū)的特異元件受激素的精確調(diào)控而行使功能。
　　 3 BmLP3啟

9、動(dòng)子核心元件的細(xì)胞水平鑒定與分析
　　 首先,對(duì)BmLP3全長(zhǎng)啟動(dòng)子進(jìn)行了5'端分段順次缺失,得到7種不同長(zhǎng)度的BmLP3啟動(dòng)子序列,將其分別克隆至pGL3-basic載體構(gòu)建成細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體Luc-F1～Luc-F7,轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)胞系BmE并通過測(cè)定相應(yīng)的Luc酶活以鑒定啟動(dòng)子的核心元件。結(jié)果表明:BmLP3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-250bp～-151bp區(qū)域參與增強(qiáng)了Luc的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。將此段區(qū)域分別制成標(biāo)記探針Probe1和P

10、robe2,與家蠶5齡7天脂肪體的核抽提物進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Probe1與核抽提物具有特異性結(jié)合。為進(jìn)一步弄清Probe1中與核蛋白結(jié)合的具體位置,將Probe1進(jìn)行三段不同位置的缺失(Probe1-1、Probe1-2、Probe1-3)后進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示探針Probe1-1與核抽提物形成了明顯的結(jié)合,而Probe1-2和Probe1-3的結(jié)合信號(hào)非常弱,說明與核蛋白結(jié)合的核心位點(diǎn)位于Probe1-1中長(zhǎng)度為21bp的序

11、列(5'AAATATACCTTTCACATGGCA3'),即位于-250～-230區(qū)域。為進(jìn)一步驗(yàn)證該21bp序列的功能,將其克隆到BmLP3的核心啟動(dòng)子區(qū)上游,即轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前50bp的5'端,轉(zhuǎn)染BmE細(xì)胞系并檢測(cè)Luc的酶活發(fā)現(xiàn),與對(duì)照Luc-F6相比,Luc的酶活提高了3.1倍,表明這21bp在細(xì)胞水平上有增強(qiáng)BmLP3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的作用。
　　 4 BmLP3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DsRed在轉(zhuǎn)基因家蠶中的表達(dá)分析
　　 為

12、檢測(cè)BmLP3啟動(dòng)子(長(zhǎng)度為1119bp)在個(gè)體水平的活性,以紅色熒光蛋白DsRed為報(bào)告基因,構(gòu)建成以3xP3-EGFP為熒光篩選標(biāo)記的pBac[BmLP3-DsRed-SV40]表達(dá)載體,經(jīng)注射篩選獲得了BmLP3-Red轉(zhuǎn)基因蠶。
　　 分子檢測(cè)和熒光觀察結(jié)果表明:
　　 1)BmLP3-DsRed表達(dá)框以單拷貝整合至家蠶基因組,插入位點(diǎn)位于第20號(hào)染色體;DsRed在轉(zhuǎn)基因家蠶脂肪體中高量轉(zhuǎn)錄表達(dá),且自幼蟲5齡4

13、天開始,在5齡5天達(dá)到較高水平,之后表達(dá)水平持續(xù)上升,在化蛹前后達(dá)到最高,蛹形成后表達(dá)量逐漸下降,至蛹7天時(shí)完全消失。其表達(dá)特征與內(nèi)源BmLP3基因基本一致。Western檢測(cè)結(jié)果證實(shí),DsRed蛋白僅在脂肪體中特異合成;將樣品脂肪體的Western blot雜交信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行灰度比對(duì)粗略估算,每10μg轉(zhuǎn)基因蠶的脂肪體中約有0.54μg重組DsRed蛋白。
　　 2)對(duì)陽(yáng)性個(gè)體于胚胎發(fā)育后期進(jìn)行連續(xù)的熒光觀察,發(fā)現(xiàn)在5齡4天

14、幼蟲時(shí)觀察到蠶體后部開始發(fā)出紅色熒光,隨著家蠶的發(fā)育,到5齡7天幼蟲時(shí)可觀察到整個(gè)蠶體都發(fā)出了明亮的紅色熒光。取轉(zhuǎn)基因蠶的不同組織進(jìn)行熒光觀察,結(jié)果僅在脂肪體中有紅色熒光信號(hào)發(fā)出,其它組織如絲腺、中腸、血液和生殖腺中無熒光信號(hào);化蛹之后,整個(gè)蛹體亦有明亮的紅色熒光信號(hào)。對(duì)多個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)紅色熒光蛋白在雌雄個(gè)體中均有表達(dá);不同個(gè)體間的表達(dá)水平有一定的差異,這種差異出現(xiàn)在不同轉(zhuǎn)基因系的個(gè)體中,也會(huì)出現(xiàn)在同一個(gè)單拷貝個(gè)體回交的后

15、代中。
　　 5 BmLP3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)phyA在轉(zhuǎn)基因家蠶中的表達(dá)分析
　　 為進(jìn)一步探索利用BmLP3啟動(dòng)子開發(fā)家蠶脂肪體生物反應(yīng)器的可行性,以在飼料添加劑工業(yè)上具有重要應(yīng)用價(jià)值的植酸酶(phyA)基因?yàn)榘袠?biāo),構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pBac[BmLP3-phyA-SV40.3xP3EGFP],以實(shí)用蠶品種“7532”為受體,經(jīng)顯微注射篩選獲得了BmLP3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)植酸酶表達(dá)的轉(zhuǎn)基因蠶。分子檢測(cè)結(jié)果表明:植酸酶基因已成功插

16、入至家蠶基因組并有轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　 取化蛹后2天的轉(zhuǎn)基因蠶蛹總蛋白,以提取自小麥的植酸酶標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照,分別在pH值5.5、溫度為0℃、37℃和55℃的條件下,采用國(guó)標(biāo)法(GB/T18634-2009)測(cè)定重組植酸酶的酶活,結(jié)果顯示:重組植酸酶具有生物活性,在0℃～55℃間,其活性隨著溫度的升高逐漸增強(qiáng),55℃時(shí)酶活達(dá)到5.1U/g,提示此溫度條件是保持重組植酸酶酶活的最適溫度。本研究初步證實(shí),利用家蠶脂肪體作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)