海生素對白血病細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、目的： 探討海生素對白血病細(xì)胞K562及其耐藥細(xì)胞K562/ADM體外增殖的抑制作用，對K562及K562/ADM細(xì)胞凋亡和K562細(xì)胞周期的影響，對K562/ADM細(xì)胞耐藥相關(guān)mdrl和Sorcin基因及其蛋白表達(dá)的影響。 方法： 采用MTT法測定海生素對K562及K562/ADM細(xì)胞的體外抑制作用，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax的表達(dá)，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞早期凋亡率、細(xì)胞周期和Pgp蛋白表達(dá)，

2、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測mdrl和Sorcin基因表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western blot檢測Sorcin蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、海生素在低濃度 0.1、1μg.ml<'-1>時對K562細(xì)胞無生長抑制現(xiàn)象，細(xì)胞存活率分別為 96.23％、86.12％，而濃度為 10μg.ml<'-1>時細(xì)胞存活率為68.46％，細(xì)胞數(shù)明顯減少，在此濃度下隨時間的延長細(xì)胞存活率有下降趨勢。較大

3、濃度100μg.ml<'-1>時細(xì)胞大部分死亡。 2、海生素在低濃度0.1、1、10μg.ml<'-1>時對K562/ADM細(xì)胞無生長抑制現(xiàn)象，海生素在濃度為40μg.ml<'-1>時，可有明顯的細(xì)胞生長抑制現(xiàn)象，且隨時間的延長生長抑制越明顯，具有時效關(guān)系。 3、流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)海生素在濃度10μg.ml<'-1>時可阻止K562細(xì)胞周期于G<,1>/S期。 4、海生素在20ug.ml<'-1>濃度時，作用K5

4、62細(xì)胞12小時，流式細(xì)胞儀檢測早期細(xì)胞凋亡率為(10.53±2.45)％與對照組(2.46±1.28)％比較p<0.05，在36小時早期細(xì)胞凋亡率為(35.45±3.21)％；隨濃度的增加和時間的延長細(xì)胞凋亡明顯，可出現(xiàn)細(xì)胞死亡。 5、海生素在濃度為40ug.ml<'-1>時作用K562/ADM 細(xì)胞可檢測到細(xì)胞凋亡亞G<,1>峰，海生素 (40μg.ml<'-1>)作用0、12、24、36、48、72小時，測定細(xì)胞早期凋亡率

5、，細(xì)胞凋亡率隨時間的延長，在12、24小時凋亡率增加，而在36、48、72小時后細(xì)胞凋亡率增加不明顯。 6、海生素在濃度為 20μg.ml<'-1>和40μg.ml<'-1>時bcl-2 蛋白表達(dá)率為(58.78±4.65)％、(26.57±2.13)％。未經(jīng)海生素處理的K562細(xì)胞bcl-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)(90.98±8.66)％。對照組K562細(xì)胞bax陰性表達(dá)，海生素(10μg.ml<'-1>)處理K562細(xì)胞后bax陽性

6、表達(dá)，海生素(20μg.ml<'-1>)處理K562細(xì)胞后bax強(qiáng)陽性表達(dá)。 7、對照組耐藥細(xì)胞 bcl-2 強(qiáng)陽性表達(dá)(0.09±0.01)；海生素(20μg.ml<'-1>)處理K562 耐藥細(xì)胞 24h、48h，檢測分析 bcl-2 陽性表達(dá)灰度值分別為 0.05±0.02、0.05±0.01，和對照組比較P<0.05，實驗組bcl-2 陽性表達(dá)率與藥物濃度和作用時間有負(fù)相關(guān)性；對照組耐藥細(xì)胞bax陰性表達(dá)，海生素(20μ

7、g.ml<'-1>)處理K562耐藥細(xì)胞后bax弱陽性表達(dá)，海生素(40μg.ml<'-1>)處理K562耐藥細(xì)胞后bax強(qiáng)陽性，實驗組bax陽性表達(dá)率與藥物濃度和作用時間有正相關(guān)性。海生素在一定濃度下對K562 及其耐藥細(xì)胞可上調(diào)bax蛋白表達(dá)而對bcl-2蛋白下調(diào)其表達(dá)。 8、通過PCR檢測不同濃度藥物對耐藥細(xì)胞mdrl表達(dá)無影響。 9、PCR 檢測也同樣發(fā)現(xiàn)不同濃度藥物對耐藥細(xì)胞Sorcin表達(dá)基因的無影響；應(yīng)用

8、Western blot檢測K562/ADM細(xì)胞Sorcin蛋白的表達(dá)。經(jīng)圖像分析K562/ADM細(xì)胞組Sorcin蛋白的表達(dá)與對照組無差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1、海生素可抑制K562和K562/ADM細(xì)胞生長； 2、海生素可影響bcl-2 和bax蛋白表達(dá)使 K562細(xì)胞生長周期停滯于G<,1>/S期； 3、海生素可通過下調(diào)bcl-2 蛋白表達(dá)、上調(diào)細(xì)胞bax蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡； 4