山羊IL-18定量抗原捕獲ELISA檢測方法的建立及其免疫增強(qiáng)作用的研究.pdf

1、IL-18是一種屬于IL-1家族且分布廣泛的細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能，其中對(duì)機(jī)體的免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用已受到研究者們的極大關(guān)注。人類醫(yī)學(xué)研究證明IL-18在抗微生物感染，尤其是在抗腫瘤免疫方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。且單克隆抗體比多克隆抗體具有較好的優(yōu)越性，廣泛應(yīng)用到各種疾病的檢測、診斷及防治中，并為各種病原微生物的流行病學(xué)的分析提供了強(qiáng)有力的工具，極大地提高了臨床疾病診斷和治療的效率。
　　 本課題對(duì)山羊IL-18（g

2、IL-18）的單克隆抗體進(jìn)行了研究。將山羊IL-18的成熟蛋白基因經(jīng)擴(kuò)增后克隆入原核表達(dá)載體pET-28a（+）中，經(jīng)鑒定和測序后，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-gIL-18。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌Rosetta（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組蛋白的表達(dá)，并利用載體上所帶有的His標(biāo)簽蛋白這一特點(diǎn)，采用Ni-NTA親和層析法純化重組蛋白gIL-18，從而獲得了純度較高的蛋白，為下一步進(jìn)行小鼠免疫及單抗的篩選鑒定做好準(zhǔn)備。

3、r>　　 利用純化的重組gIL-18蛋白對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，并建立了檢測小鼠抗體水平和單抗鑒定的間接ELISA檢測方法，融合前抗體效價(jià)達(dá)到1:107，滿足融合時(shí)對(duì)小鼠抗體的要求。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與加強(qiáng)免疫后的小鼠脾細(xì)胞在PEG作用下進(jìn)行融合，經(jīng)間接ELISA方法檢測融合細(xì)胞，對(duì)于陽性雜交瘤細(xì)胞，通過有限稀釋法進(jìn)行多次克隆化，以篩選出能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，并最終確定下兩株單抗2E8和4C4作為試驗(yàn)研究對(duì)象，并進(jìn)行了單抗

4、腹水的大量制備，利用飽和硫酸銨法對(duì)腹水進(jìn)行粗提，再進(jìn)一步利用Protein G親和層析柱進(jìn)行純化，通過SDS-PAGE電泳分析，得到了純度較高的IgG。
　　 通過對(duì)此兩種單抗的亞型鑒定表明，此兩種單抗均屬于IgG1亞型。兩種單抗2E8和4C4的效價(jià)分別為1:105和1:104。經(jīng)ELISA疊加試驗(yàn)分析表明2E8和4C4可分別結(jié)合到IL-18的不同的抗原位點(diǎn)上，兩者具有疊加性。經(jīng)Western blot鑒定表明，單抗2E8和4C

5、4能夠與重組gIL-18蛋白發(fā)生特異性的反應(yīng)，且anti-His單抗也可以與重組gIL-18蛋白發(fā)生特異反應(yīng)，而與hIFN-γ蛋白不發(fā)生特異反應(yīng)，與多抗相比，單抗特異性較強(qiáng)，蛋白印跡條帶清晰。經(jīng)IFA鑒定表明，對(duì)于gIL-18的重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1-gIL-18轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞表達(dá)情況的檢測，可以利用單抗的特異性，試驗(yàn)證實(shí)單抗可以特異性的檢測真核質(zhì)粒在細(xì)胞上的表達(dá)，產(chǎn)生特異明顯的熒光，且對(duì)重組Bacmid-gIL-18轉(zhuǎn)染sf

6、9昆蟲細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行IFA檢測也獲得相似的結(jié)果。
　　 通過對(duì)山羊IL-18單抗的研究旨在建立山羊IL-18定量抗原捕獲ELISA檢測方法，利用對(duì)其中一種單抗2E8進(jìn)行辣根過氧化物酶（HRP）的標(biāo)記并對(duì)其特性及效價(jià)（1:6000）進(jìn)行測定，另一種單抗4C4作為捕獲抗體，通過對(duì)所需包被抗體（單抗4C4）最佳工作濃度、HRP-2E8-IgG二抗最佳稀釋比例和ELISA最佳反應(yīng)條件等進(jìn)行研究，經(jīng)方陣滴定試驗(yàn)最終確立了檢測山羊IL-18

7、的定量抗原捕獲ELISA的檢測方法，并依次建立了檢測山羊IL-18的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測靈敏度為16pg/mL，且對(duì)其他細(xì)胞因子如hIFN-γ和hIL-18應(yīng)用此檢測方法進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明無交叉反應(yīng)，檢測值均低于16pg/mL的最小檢出限，此檢測方法對(duì)于山羊IL-18的檢測具有一定的特異性。應(yīng)用此方法檢測體外山羊PBMC在LPS刺激下產(chǎn)生的IL-18的水平，及其健康奶牛和奶牛乳腺炎患牛（山羊IL-18和牛IL-18氨基酸同源性為98％）的血清

8、及乳清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，山羊PBMC在LPS刺激下IL-18檢測含量為85～267 pg/mL，與細(xì)胞陰性對(duì)照相比，gIL-18含量有顯著提高；健康奶牛血清中IL-18含量為44～135 pg/mL，相比之下，病患牛血清中IL-18含量有明顯升高，在111～534 pg/mL之間；健康奶牛乳清中IL-18含量為83～167 pg/mL，病患牛乳清中IL-18含量有明顯升高，在171～658 pg/mL之間。此檢測方法可以對(duì)機(jī)體體內(nèi)和體

9、外在炎癥反應(yīng)時(shí)IL-18的水平進(jìn)行定量的檢測，從而為各種臨床疾病的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。
　　 同時(shí)，針對(duì)IL-18具有免疫治療及免疫增強(qiáng)作用這一功能，將山羊具有生物學(xué)活性IL-18蛋白（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、表達(dá)并保存的重組桿狀病毒表達(dá)的rBgIL-18蛋白）作為免疫調(diào)節(jié)劑，聯(lián)合口蹄疫O型、亞洲1型二價(jià)滅活疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物山羊分別進(jìn)行rBgIL-18蛋白與疫苗共免疫組（Ⅰ組）、rBgIL-18蛋白預(yù)免疫+疫苗組（Ⅱ組）、單用疫苗組（Ⅲ組

10、）和生理鹽水陰性對(duì)照組（Ⅳ組）等分組試驗(yàn)，以期對(duì)IL-18的免疫增強(qiáng)作用更好地進(jìn)行詮釋和應(yīng)用，從體液免疫和細(xì)胞免疫水平上分析試驗(yàn)結(jié)果。通過使用口蹄疫O型和亞洲1型檢測試劑盒檢測各試驗(yàn)期血清中的抗體滴度，從統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上分析處理數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，與免疫前相比，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組都有較好的免疫效果，抗體水平都較高且維持時(shí)間也較長，Ⅰ組可以較快（42d）達(dá)到高抗體水平；與陰性對(duì)照組相比，Ⅰ組效果最好，抗體效價(jià)最高，維持時(shí)間也最長，Ⅱ組次之。而且，利用M