轉(zhuǎn)基因干涉ie-2和lef-3基因?qū)mNPV體外增殖的影響.pdf

1、家蠶核型多角體病毒是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見(jiàn)且危害最嚴(yán)重的一類病原微生物，對(duì)其研究具有重要的科學(xué)意義和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)選擇了家蠶核型多角體病毒的早期表達(dá)基因ie2及晚期表達(dá)因子lef3這兩個(gè)與病毒復(fù)制、增殖密切相關(guān)的基因作為抑制靶標(biāo)，通過(guò)構(gòu)建能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄形成靶標(biāo)基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因干涉載體(pigA3EGFP-39KPie2，pigA3EGFP-39KPlef3，pigA3EGFP-IE1Plef3)轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)胞系(BmE)。通過(guò)G41

2、8的壓力選擇，獲得能穩(wěn)定產(chǎn)生dsRNA的三種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。線性化修飾過(guò)的病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV的攻毒試驗(yàn)表明：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能產(chǎn)生目標(biāo)基因dsRNA，對(duì)病毒在細(xì)胞中的復(fù)制、增殖均有一定的抑制作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　 (1)、靶基因片段的克隆
　　 克隆了家蠶核型多角體病毒(BmNPV)復(fù)制和增殖過(guò)程中的比較重要的兩個(gè)基因——極早期表達(dá)基因ie-2和晚期表達(dá)因子lef-3的部分區(qū)

3、域：ie-2基因的+623～+1186區(qū)域(共564bp)和lef-3基因的+233～+926區(qū)域(共694bp)的片段。
　　 (2)、轉(zhuǎn)基因干涉載體的構(gòu)建
　　 利用包含兩個(gè)不同啟動(dòng)子——極早期表達(dá)基因ie-1的啟動(dòng)子和遲早期基因39k的啟動(dòng)子的載體骨架，將目的基因片段以反向串聯(lián)方式連接，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因干擾載體pigA3-EGFP-39KPie2、pigA3-EGFP-39KPlef3和pigA3-EGFP-IE1Ple

4、f3。這些載體上都含有EGFP作為報(bào)告基因，以neo作為抗性篩選標(biāo)記。
　　 (3)、篩選并獲得轉(zhuǎn)基因干涉細(xì)胞系
　　 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的對(duì)BmNPV敏感的家蠶胚胎細(xì)胞系(BmE)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并通過(guò)抗生素G418壓力篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)干涉靶基因相應(yīng)dsRNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
　　 (4)、轉(zhuǎn)基因干涉載體對(duì)病毒體外增殖的影響
　　 分別接種線性化修飾過(guò)的家蠶核型多角體病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV，研究