BVDV-2分離株XJ-04全基因組測序和抗BVDV單克隆抗體制備及初步應(yīng)用.pdf

1、牛病毒性腹瀉病(Bovine viral disease，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起牛的一種多臨床癥狀的傳染病，目前呈世界性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV分為基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。自20世紀(jì)80年代末，BVDV-2首次分離于加拿大和美國爆發(fā)急性的BVD中。BVDV-2主要引起腹瀉，免疫耐受與持續(xù)性感染，先天性缺陷，母畜流產(chǎn)、

2、產(chǎn)死胎和畸形胎等；高毒力的BVDV-2還能引起血小板減少癥和出血綜合癥。BVDV-1在我國牛群中流行普遍，2009年BVDV-2首次在我國分離報道。因此，本研究將集中如下兩部分：一、制備抗BVDV單克隆抗體，基于生物素-親和素系統(tǒng)建立雙抗體夾心ELISA檢測方法；二、對分離鑒定的BVDV-2 XJ-04株全基因組序列進(jìn)行測序分析及基因分型。上述研究旨在為我國牛病毒性腹瀉病的分子流行病學(xué)研究和診斷方法奠定基礎(chǔ)。
　　 研究一：采用

3、分段RT-PCR方法擴(kuò)增BVDV-2 XJ-04株的18個片段，分別為A-Q、5'和3'-UTR部分序列。除了5'和3'-UTR部分序列外，內(nèi)側(cè)的17個基因片段末端相互重疊；5'和3'-UTR部分序列是在RNA連接酶作用下將RNA5'和3'端自我連接后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。將各序列進(jìn)行拼接后成功獲得了BVDV-2 XJ-04株的全長為12,284bp的全基因組序列，并在GenBank中進(jìn)行注冊，登錄號為FJ527854。通過5'-UTR

4、及全基因組序列進(jìn)化樹分析，并結(jié)合自我裂解酶(Npro)及結(jié)構(gòu)蛋白(C、Ems、E1、E2)與標(biāo)準(zhǔn)株NADL(BVDV-1)和890(BVDV-2)進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列同源性比較分析，結(jié)果表明XJ-04與890、NewYork93的親緣關(guān)系最近，歸入BVDV-2a亞型。
　　 研究二：將經(jīng)PEG濃縮、蔗糖墊底純化的890毒株(BVDV-2)作為制備單克隆抗體的免疫原；免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，以pET28a-

5、BE2的原核表達(dá)產(chǎn)物BE2為檢測抗原進(jìn)行間接ELISA篩選，得到1株分泌性能穩(wěn)定、抗體分子類為IgG、腹水ELISA滴度為1：216的單克隆抗體(McAb)雜交瘤細(xì)胞株，命名為3F9。3F9對豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、1型牛皰疹病毒(Bovine herpes virus-1，BHV-1)、牛輪狀病毒(Bovine rota virus，BRV)均無交叉反應(yīng)，顯示3F9具有良好的特異性

6、。利用該單克隆抗體的高特異性以及Biotin-avidinsystem(BAS)系統(tǒng)的靈敏性，設(shè)計了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測BVDV的雙抗體夾心ELISA方法，單克隆抗體IgM為捕獲抗體，biotin標(biāo)記的3F9作為第二抗體。方陣滴定實驗確定捕獲抗體最佳工作濃度為2ug/mL，Biotin-3F9工作效價為60ng/mL，BE2最低檢出量為84ng/mL。建立雙抗體夾心ELISA方法檢測35份病牛血清樣本，13份為陽性；與RT-PC