轉(zhuǎn)基因玉米3272檢測(cè)方法及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建.pdf

1、為了保障我國乃至全球轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)管理制度的順利實(shí)施，本文主要從兩個(gè)方面開展了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)研究。 轉(zhuǎn)基因玉米3272品系特異性檢測(cè)方法的建立：基于轉(zhuǎn)基因玉米3272的3’端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)了品系特異性的引物和探針，通過優(yōu)化引物、探針等技術(shù)參數(shù)，建立了品系特異性定性、定量PCR檢測(cè)方法。并構(gòu)建了一個(gè)適于轉(zhuǎn)基因玉米3272品系特異性單一和復(fù)合PCR定性定量檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子p3272。建立的單一和復(fù)合定性PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)

2、靈敏度（LOD）均為0.05％，相當(dāng)于25個(gè)拷貝玉米單倍體基因組DNA?；趐3272建立的單一和復(fù)合熒光定量PCR擴(kuò)增體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很高的反應(yīng)效率和相關(guān)系數(shù)，重復(fù)性和重演性的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）值均小于0.2，絕對(duì)LOD和LOQ均為10拷貝和25拷貝。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部組織了5人協(xié)同實(shí)驗(yàn)對(duì)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子p3272及其檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，利用構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子及其檢測(cè)方法獲得實(shí)際樣品定量檢測(cè)結(jié)果與真實(shí)值偏差小于25％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（

3、RSD）值小于25％，表明所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子及其品系特異性PCR檢測(cè)方法完全適用于轉(zhuǎn)基因玉米3272檢測(cè)。 轉(zhuǎn)基因玉米質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制：利用分子克隆手段，本文構(gòu)建了適合于轉(zhuǎn)基因玉米GA21、NK603、MON810、MON863、TC1507、Bt11、Bt176、T25品系特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子pGA、pNK、p810、p863、pTC、pBt11、pBt176、pT25。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子中均包含玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb序列和對(duì)應(yīng)的

4、外源品系特異性序列，并且在內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源品系特異性序列間插入了一段2463bp的特異性DNA片段用于復(fù)合PCR檢測(cè)。本文以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pTC為例，建立了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適合性、均勻性、穩(wěn)定性、定值和不確定度測(cè)定等技術(shù)方法和體系。在適合性測(cè)試中，pTC針對(duì)TC1507玉米具有高特異性，pTC作為檢測(cè)對(duì)照，靈敏度低至為50個(gè)拷貝。在均勻性測(cè)試中，我們隨機(jī)抽取了15份pTC樣品（106copies/μL），通過測(cè)試比較pTC的zSSIIb和品系

5、特異性序列擴(kuò)增的Ct值、平均拷貝數(shù)間的差異，及與總體平均值間的差異等，結(jié)果證明15個(gè)份樣品間的差異無顯著水平（p>0.05）。在穩(wěn)定性測(cè)試中，分別設(shè)定了在不同貯存溫度和保存時(shí)間條件下處理pTC質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，對(duì)其zSSIIb和品系特異性序列擴(kuò)增的Ct值和拷貝數(shù)分析結(jié)果顯示：在室溫和4℃保存四周條件下，pTC質(zhì)粒DNA穩(wěn)定；在37℃貯存四周條件下，pTC質(zhì)粒DNA才有明顯的降解趨勢(shì)。在定值和不確定度測(cè)試中，通過測(cè)序和熒光定量PCR的方法分析