楊樹內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定及TasA基因的克隆與表達(dá).pdf

1、潰瘍病是楊樹枝干上的重大病害，是國(guó)內(nèi)外林木上的重大生物災(zāi)害，基于內(nèi)生細(xì)菌發(fā)展生物制劑來控制楊樹潰瘍病較傳統(tǒng)的化學(xué)防治更有前途；而物種的最終鑒定也是至關(guān)重要的，因?yàn)樯锓乐我约爸参镒陨泶偕镔|(zhì)包括抗細(xì)菌、抗真菌的多肽類，胞外植酸酶、幾丁質(zhì)酶的合成都具是菌株特異性。 本研究所采用的分子鑒定手段有利于楊樹內(nèi)生細(xì)菌近緣種的鑒定：同時(shí)利用生物信息學(xué)方法研究了解淀粉芽孢桿菌TasA基因的特性，原核表達(dá)出TasA融合蛋白。本研究包括以下三部分

2、： (1)楊樹內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定 對(duì)從楊樹水泡潰瘍病斑處分離篩選得到的15株楊樹內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了16S rRNA測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)鑒定其分別屬于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)以及蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。 結(jié)合Genbank中其它芽孢桿菌16S rRN

3、A的序列分析發(fā)現(xiàn)，16S rRNA對(duì)區(qū)別和鑒定親緣距離較遠(yuǎn)的楊樹內(nèi)生芽孢桿菌是簡(jiǎn)便和正確的，但對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種卻存在一定不足；而芽孢桿菌16S rRNA在核酸115-485存在高變區(qū)，202、285、465、472、483五個(gè)位點(diǎn)的堿基多態(tài)性，有益于楊樹內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定，對(duì)芽孢桿菌屬細(xì)菌的分子鑒定也是一個(gè)有益補(bǔ)充。而基于多態(tài)位點(diǎn)選取的Fnu4H I、Rsa I、Taq I3種內(nèi)切酶中的任何一種的酶切圖譜可同時(shí)鑒定B.megate

4、rium、B.amyloliquefaciens、B。subtilis以及B.cereus。 TasA及其類似基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，B.amyloliquefaciens同B.subtilis核酸序列的同源性為74％，氨基酸序列的同源性也僅為80％左右，說明TasA序列分析可以作為芽孢桿菌分類鑒定的一種輔助手段。 (2)解淀粉芽孢桿菌PEBA20 TasA功能基因的序列分析 TasA基因ORF全長(zhǎng)786bp，共編

5、碼了261個(gè)氨基酸，分子量為28.123KD，等電點(diǎn)為6.82；該基因在GenBank中注冊(cè)的登記號(hào)為FJ718530。 解淀粉芽孢桿菌PEBA20 TasA蛋白的信號(hào)肽區(qū)位于分泌蛋白TasA的N端，由27個(gè)氨基酸組成。通過氨基酸組成分析可發(fā)現(xiàn)：一些疏水氨基酸所占比例較大，連續(xù)幾個(gè)疏水氨基酸在信號(hào)肽區(qū)組成了疏水核心。TasA蛋白的跨膜區(qū)域也集中在氨基酸序列3-30，長(zhǎng)度為28aa。而在整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，有54個(gè)氨基酸殘基為Q.螺旋