SMYD3在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中表達(dá)及功能的研究.pdf

1、SMYD3是組蛋白3第4位賴氨酸二甲基化、三甲基化特異性轉(zhuǎn)移酶，具有執(zhí)行甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SET結(jié)構(gòu)域和參與蛋白互作、識別特異DNA序列的MYND鋅指基序。SMYD3通過結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)序列催化形成H3K4me3活性轉(zhuǎn)錄標(biāo)志，而調(diào)節(jié)其下游一系列基因的激活和表達(dá)，其中包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶等。牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中一直維持H3K4me3修飾狀態(tài)。目前只發(fā)現(xiàn)兩種特異性催化H3K4me3的酶SMYD3和Meisetz。Meisetz只在兩性生殖

2、細(xì)胞減數(shù)分裂前復(fù)制期到粗線期過程中表達(dá)，粗線期后不再表達(dá)，說明粗線期后有其他特異性甲基轉(zhuǎn)移酶維持H3K4me3修飾狀態(tài)，其中，SMYD3可能在這一過程中起重要作用。SMYD3的作用機(jī)理在癌細(xì)胞中已被廣泛研究，但在卵母細(xì)胞成熟、受精及早期胚胎發(fā)育過程中的研究還很有限。本研究首先對牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中SMYD3基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究；同時(shí)針對SMYD3 mRNA上游、中游、下游設(shè)計(jì)抑制位點(diǎn)專一性的短干擾RNA片段

3、(siRNA)，對牛GV期去顆粒細(xì)胞卵母細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合注射，研究在成熟過程中干擾SMYD3 mRNA表達(dá)對牛卵母細(xì)胞成熟、受精及早期胚胎發(fā)育的影響，并對體外受精7h的合子進(jìn)行注射，研究受精后干擾SMYD3 mRNA表達(dá)對早期胚胎發(fā)育的影響。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ⑴在建立的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，0、8、12、18、24 h分別有82.9%、80.3%、75.1%、63.3%、70.9%比例的卵母細(xì)胞處于GV期、PMI期、MI期、AI-

4、TI期、MII期。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，可用0、8、12、18、24h體外培養(yǎng)時(shí)間作為收集處于減數(shù)分裂GV期、PMI期、MI期、AI-TI期、MII期的卵母細(xì)胞的依據(jù)。用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測SMYD3 mRNA在牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中表達(dá)的結(jié)果顯示：牛SMYD3 mRNA在牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期持續(xù)表達(dá)，相對于GV期，表達(dá)水平在MI期、AI-TI期明顯升高(P<0.05)，AI-TI期后到MII期逐漸下降，但差異不顯著(P>0.05)。免

5、疫化學(xué)方法檢測SMYD3蛋白表達(dá)結(jié)果表明：SMYD3在AI-TI期大量翻譯蛋白并到MII期蛋白量持續(xù)上升，且始終圍繞在染色體的周圍。說明SMYD3 mRNA的積累主要在AI-TI期之前完成，蛋白的大量合成和發(fā)揮作用始于AI-TI期，可能對維持后期H3K4me3基因轉(zhuǎn)錄激活信號的形成起關(guān)鍵作用。在SMYD3 mRNA表達(dá)的研究中，檢測到一個(gè)未見報(bào)道的SMYD3轉(zhuǎn)錄本。測序結(jié)果與基因組DNA全序列比對，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄本位于此基因7號內(nèi)含子DNA

6、序列9803-9913bp，符合真核生物GT-AG傳統(tǒng)剪接方式，也可作為外顯子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究顯示來自不同個(gè)體的卵母細(xì)胞或來自同一個(gè)體的不同組織肝臟、肺臟、睪丸、脾臟及心臟都存在相同的轉(zhuǎn)錄本，表明SMYD3此種可變剪接無個(gè)體和組織特異性。
　　 ⑵針對牛SMYD3 mRNA的第281-299、567-585、1030-1048bp區(qū)域分別設(shè)計(jì)siRNA干涉序列，三片段聯(lián)合對GV期去顆粒細(xì)胞的裸卵進(jìn)行顯微注射，培養(yǎng)24h后SM

7、YD3 mRNA的表達(dá)量與對照組相比下降到18%，干擾效率顯著。GV期去顆粒細(xì)胞的裸卵注射SMYD3-siRNA研究結(jié)果表明：SMYD3-siRNA注射組與陰性對照Nos-siRNA注射組(無義干擾片段)成熟率無顯著差異(67.14% vs66.06%，P>0.05)，說明干擾SMYD3 mRNA的表達(dá)不影響卵母細(xì)胞的成熟。非注射對照組卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)和GV期去顆粒細(xì)胞裸卵(DOs)的成熟率無顯著差異(75.54% vs7

8、6.19%，P>0.05)，說明GV期機(jī)械去除顆粒細(xì)胞不影響卵母細(xì)胞成熟；但注射組與非注射組體外成熟率差異極顯著(67.14%、66.06% vs75.54%、76.19%，P<0.01)，可能是由于顯微注射操作過程中的機(jī)械損傷造成。GV期進(jìn)行胞質(zhì)注射SMYD3-siRNA實(shí)驗(yàn)組、注射Nos-siRNA陰性對照組及非注射組對照組COCs、DOs各組卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)22h后進(jìn)行體外受精。結(jié)果顯示：SMYD3-siRNA注射組、DOs組

9、、Nos-siRNA注射組之間卵裂率均無顯著差異(44.07% vs42.8% vs42.95%，P>0.05)；但SMYD3-siRNA注射組的8細(xì)胞率、囊胚率顯著低于DOs組、Nos-siRNA注射組(3.29% vs17.51%、12.82%；0%vs10.89%、8.33%，P<0.01)，表明GV期去顆粒細(xì)胞裸卵注射SMYD3-siRNA不影響卵母細(xì)胞的受精和卵裂，但顯著降低8細(xì)胞率和囊胚率，可能是因?yàn)镾MYD3激活了某些在胚

10、胎由2細(xì)胞到囊胚發(fā)育過程中起重要作用的基因。而DOs與Nos-siRNA注射組的8細(xì)胞率、囊胚率均無顯著差異(17.51% vs12.82%，10.89% vs8.33%，P>0，05)，說明顯微注射的機(jī)械損傷對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響。另外，COCs與DOs、Nos-siRNA注射組、SMYD3-siRNA注射組的卵裂率、8細(xì)胞率、囊胚率差異均極顯著(66.95% vs42.8%、42.95%、44.07%；40.34% vs17.51%、1

11、2.82%、3.29%；30.47% vs10.89%、8.33%、0%，P<0.01)，說明顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞的體外受精過程有重要作用。
　　 ⑶對經(jīng)體外成熟并受精7h后的合子進(jìn)行SMYD3-siRNA注射實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：SMYD3-siRNA注射組與對照組非注射受精卵、Nos-siRNA注射組的卵裂率、8細(xì)胞率、囊胚率均無顯著差異(55.88% vs56.88% vs58.43%；32.35% vs34.94% vs31.9

12、0%；23.83% vs29.0% vs24.01%， P>0.05)。說明SMYD3影響胚胎由2細(xì)胞到囊胚發(fā)育的機(jī)能不是在受精后建立的。綜上所述，GV期去顆粒細(xì)胞裸卵干擾SMYD3 mRNA表達(dá)后不影響牛卵母細(xì)胞體外成熟、受精及卵裂，但嚴(yán)重降低2細(xì)胞胚胎到囊胚的發(fā)育，而受精后7h再干擾合子的SMYD3 mRNA表達(dá)對卵裂、2細(xì)胞、8細(xì)胞及囊胚的發(fā)育都沒有影響。由此說明，SMYD3通過激活某些在胚胎從2細(xì)胞到囊胚正常發(fā)育中起重要作用的基