MDV-1 CVI988疫苗株VP22及UL13蛋白功能初步研究.pdf

1、血清I型馬立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirusserotype1，MDV-1)的UL49基因和UL13基因分別和單純皰疹病毒I型的UL49及UL13基因同源，各自編碼大小約27.6kDa和57.1kDa大小的蛋白，在HSV-1中，這兩種蛋白均為主要的被膜蛋白。VP22被發(fā)現(xiàn)在不存在其他病毒蛋白的情況下具備蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，并且目前已經(jīng)有很多研究表明VP22能夠轉(zhuǎn)運(yùn)其它蛋白在細(xì)胞間擴(kuò)散，使其在克服基因治療和基因免疫的缺陷方面

2、具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。而UL13作為病毒自身編碼的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在病毒復(fù)制、組裝、以及調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯方面發(fā)揮著重要作用。在HSV中，VP22是UL13的主要病毒蛋白底物，并且有研究發(fā)現(xiàn)VP22的磷酸化可能影響該蛋白的定位，而在MDV中還未有類似報(bào)道。 目前關(guān)于MDVVP22及UL13的研究相對(duì)較少，究竟MDVVP22是否也能作為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的工具?又有哪些蛋白能夠被該蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)？MDVVP22的轉(zhuǎn)運(yùn)功能是否能夠增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)目

3、的蛋白的免疫應(yīng)答水平？VP22的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性又如何？在MDV中，UL13是否能夠磷酸化VP22?該磷酸化修飾對(duì)VP22又有何影響？這些都需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索。本研究旨在通過對(duì)上述問題的探索，為VP22進(jìn)一步走向應(yīng)用打好基礎(chǔ)。 1.VP22轉(zhuǎn)運(yùn)異源蛋白的研究 MDVVP22具有獨(dú)立的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，能夠在細(xì)胞間高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，為進(jìn)一步探索該蛋白作為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)工具的可行性，本研究構(gòu)建了GFP、AIV-NP、BoIFN-γ、IBDV-V

4、P2以及NDV-F基因與MDV-1VP22融合表達(dá)的重組質(zhì)粒，并將所獲得的重組質(zhì)粒在COS-1上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)以觀察上述不同融合蛋白在COS-1細(xì)胞上的定位情況，從而評(píng)價(jià)VP22對(duì)這4種蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP、AIV-NP及BoIFN-γ在與VP22融合表達(dá)的狀態(tài)下能夠被VP22高效轉(zhuǎn)運(yùn)，而VP22對(duì)NDV-F的轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低，對(duì)IBDV-VP2則完全不具備轉(zhuǎn)運(yùn)能力。此外，被VP22轉(zhuǎn)運(yùn)后的蛋白均定位在細(xì)胞核內(nèi)。這些研究結(jié)果說明MD

5、VVP22能夠作為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的載體，但對(duì)所轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有選擇性，并且VP22能夠改變被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白原始的細(xì)胞定位。 2.VP22增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)目的抗原免疫應(yīng)答水平的評(píng)價(jià) MDVVP22蛋白具備蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與VP22融合表達(dá)的GFP、AIV-NP、BoIFN-γ以及NDV-F等蛋白，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)VP22對(duì)這幾種蛋白的免疫增強(qiáng)效果，本研究將pNP-VP22、pBoIFN-γ-VP22及pF-VP22的重組表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒

6、免疫Balb/c小鼠，4免后采取小鼠血清并分離小鼠淋巴細(xì)胞，通過ELISA、ELISPOT以及流式細(xì)胞法檢測(cè)各組小鼠的免疫應(yīng)答水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VP22能夠特異性增強(qiáng)BoIFN-γ的細(xì)胞免疫水平，而對(duì)其體液免疫沒有多大的影響。相反，NP蛋白的體液免疫水平卻顯著增強(qiáng)，但細(xì)胞免疫增強(qiáng)的效果不明顯。而對(duì)于F蛋白，VP22幾乎對(duì)其無任何的免疫增強(qiáng)的效果。上述結(jié)果顯示，MDV-1VP22具備增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)目的抗原的免疫應(yīng)答的功能，但免疫應(yīng)答的類型可能

7、會(huì)受到VP22蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)方式的影響。 3.VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究 MDVVP22蛋白具有獨(dú)立的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，能夠作為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的工具，但其轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞定位的機(jī)制還未確定。我們?cè)缙诘难芯堪l(fā)現(xiàn)，在MDV感染的CEF中，VP22定位于細(xì)胞核，為進(jìn)一步研究該蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及細(xì)胞定位機(jī)理，分析該蛋白在表達(dá)過程中細(xì)胞定位的影響因素，本研究通過重組人腺病毒表達(dá)VP22蛋白，并對(duì)重組病毒表達(dá)的VP22的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將重組病毒感染

8、的AD-293細(xì)胞裂解產(chǎn)物加至正常的MDBK細(xì)胞上，VP22能夠進(jìn)入幾乎所有的細(xì)胞，說明重組病毒表達(dá)的VP22蛋白具有很強(qiáng)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。進(jìn)一步鑒定VP22的細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，在重組病毒感染的AD-293細(xì)胞中，VP22首先聚集于細(xì)胞核周圍，隨后以特殊的熒光粒子的形式散在于胞漿中，有別于AD-293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的VP22及MDV感染的CEF中VP22的定位模式；同時(shí)我們也對(duì)Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的VP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)特性以

9、及VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞廣譜性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)表達(dá)的VP22也具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，并且其定位可能受到溫度的影響，而瞬時(shí)表達(dá)的VP22的轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞廣譜性的，能夠在多種細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，并且定位在細(xì)胞核內(nèi)。 4.MDV-1UL13序列對(duì)比分析及對(duì)VP22可能的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 蛋白激酶是一類龐大的蛋白家族，盡管它們的結(jié)構(gòu)、催化模式以及特異性底物都存在很大的差異，但它們的功能結(jié)構(gòu)域卻相當(dāng)保守。MDVUL13是病毒編碼的

10、蛋白激酶，本研究通過DNAStar軟件的MegAlin功能對(duì)比MDV不同毒株以及不同皰疹病毒屬的UL13氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)MDV不同毒株的UL13序列近乎相同，而不同皰疹病毒屬的UL13及相應(yīng)同源物的同源性很低，但在它們的激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守。通過CDTree軟件繪制該蛋白的遺傳分類圖譜，發(fā)現(xiàn)它與黑腹果蠅的pelle蛋白的功能結(jié)構(gòu)域?qū)儆谙嗤M(jìn)化分支，利用NCBIproteinBlast功能檢索MDVUL13保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)MDVUL13也具有

11、絲/蘇氨酸蛋白激酶的激酶結(jié)構(gòu)域，并且催化中心主要位于152-297氨基酸殘基間，利用Cn3D4.1軟件分析Blast結(jié)果，建立UL13可能的結(jié)構(gòu)模型，同時(shí)對(duì)比真核生物蛋白激酶的基序，發(fā)現(xiàn)UL13在激酶SubdomainVII保守甘氨酸殘基被絲氨酸替代，SubdomainVIII的保守非極性脯氨酸殘基被極性半胱氨酸殘基替換。利用NetPhos2.0Server對(duì)VP22進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在多個(gè)絲/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，且主要集中

12、在兩端，提示MDVVP22很有可能也是UL13的磷酸化底物。 5.UL13的原核和真核表達(dá)以及多抗血清的制備 MDVUL13蛋白是病毒自身編碼的蛋白激酶，具有類似真核細(xì)胞蛋白激酶的功能，并且在整個(gè)皰疹病毒科內(nèi)都具有保守性，為研究該蛋白激酶的功能，本研究通過PCR方法從CVI988疫苗株基因組中擴(kuò)增UL13基因，并將UL13基因片段克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastTMBac1中，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH1OBac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)

13、過轉(zhuǎn)座和藍(lán)白菌落篩選及PCR鑒定，獲得含UL13基因的重組穿梭載體。在脂質(zhì)體的輔助下將重組穿梭載體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，通過PCR驗(yàn)證獲得含UL13基因的重組桿狀病毒，命名為rBac-UL13。同時(shí)，利用GENEART(www.gcua.de)分析UL13在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)密碼子的偏嗜性；通過DNAstar抗原性分析確定UL13的高抗原性片段，進(jìn)行原核表達(dá)，并以切膠免疫方法免疫小鼠制備多抗血清，再以獲得的多抗血清檢測(cè)rBac-UL13重組毒感