錳對(duì)原代培養(yǎng)肉雞肝細(xì)胞脂肪合成關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)的影響.pdf

1、本論文通過(guò)3個(gè)試驗(yàn),研究了不同錳水平和不同形態(tài)錳源對(duì)體外原代培養(yǎng)肉雞肝臟細(xì)胞脂肪合成關(guān)鍵酶[脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthase,FAS)、蘋(píng)果酸脫氫酶(MalicDehydrogenase,MDH)]活性及其基因表達(dá)的影響,從細(xì)胞及分子水平探討了錳對(duì)肉雞脂肪合成影響的可能作用機(jī)制。
　　 試驗(yàn)一旨在建立穩(wěn)定、可靠的肉雞肝細(xì)胞體外原代培養(yǎng)技術(shù)體系,為下一步研究錳對(duì)肉雞肝細(xì)胞脂肪合成關(guān)鍵酶的影響奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。本試

2、驗(yàn)以健康的21～24日齡的AA肉公雞為試驗(yàn)動(dòng)物,采用改良的原位兩步灌注法分離肝臟細(xì)胞,以L(fǎng)eibovitz's L-15培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)。結(jié)果表明:采用改良的原位兩步灌注法分離的肉雞肝臟細(xì)胞,分散程度高,純度好,經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),一只21～24日齡的肉仔公雞的肝臟可以獲得(2±1)×109個(gè)細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)得細(xì)胞活率均在95％以上；以L(fǎng)eibovitz's L-15培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行單層原代培養(yǎng),培養(yǎng)7天

3、肝細(xì)胞仍能維持正常的細(xì)胞形態(tài),可滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的需要。
　　 試驗(yàn)二研究不同錳(源于無(wú)機(jī)氯化錳)水平對(duì)21～24日齡的肉公雞原代培養(yǎng)肝細(xì)胞中脂肪合成關(guān)鍵酶活性及其基因表達(dá)的影響。本試驗(yàn)所用肉仔雞從1日齡至手術(shù)前均飼喂除錳外所用營(yíng)養(yǎng)成分均滿(mǎn)足NRC(1994)建議的1～3周肉仔雞營(yíng)養(yǎng)需要量的玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(含錳為19.69mg／kg),使試雞處于臨界缺錳狀態(tài)。本研究共包括兩個(gè)試驗(yàn)。試驗(yàn)1根據(jù)添加不同錳水平對(duì)肉仔雞肝細(xì)胞乳酸脫氫

4、酶(lactic dchydrogenase,LDH)漏山的影響,米確定培養(yǎng)液添加錳濃度的非毒性范圍及適宜錳添加水平。試驗(yàn)2根據(jù)試驗(yàn)1的結(jié)果,在培養(yǎng)液中添加不同水平的錳培養(yǎng)肝細(xì)胞一定的時(shí)間,研究不同錳水平對(duì)原代培養(yǎng)的肉仔雞肝細(xì)胞中脂肪酸合成酶活性和基因表達(dá)的影響。試驗(yàn)1采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),在培養(yǎng)液中分別添加0 mM、0.02 mM、0.2 mM、0.5 mM和1 mM錳,共5個(gè)處理組,分別培養(yǎng)24h和48h,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù),每

5、只雞分離得到的肝細(xì)胞為一個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明:肉仔雞肝細(xì)胞經(jīng)不同錳水平培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24h和48h后,均顯著降低了肝細(xì)胞LDH的漏出(p＜0.0001),肝細(xì)胞培養(yǎng)液中L,DH的活性隨錳添加水平的增加呈明顯的二次曲線(xiàn)降低,錳的適宜添加水平為0.56～0.57 mM,錳添加水平為1mM時(shí)沒(méi)有對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性。試驗(yàn)2采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),在培養(yǎng)液中分別添加0mM、0.25 mM、0.5 mM和0.75 mM錳,共4個(gè)處理組,分別培養(yǎng)24h

6、和48h,每個(gè)處理6個(gè)重復(fù),每只雞分離得到的肝細(xì)胞為一個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明:不同錳添加水平培養(yǎng)液培養(yǎng)24h對(duì)肝細(xì)胞中FAS和MDH活性及其mRNA水平均無(wú)顯著影響(p＞0.24),但添加錳有降低MDHmRNA水平的趨勢(shì)。不同錳添加水平培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,顯著降低了肝細(xì)胞中FAS和MDHmRNA水平(p＜0.001),且隨著錳添加水平的增加,FAS和MDH mRNA水平有下降趨勢(shì)；添加錳對(duì)FAS和MDH的活性無(wú)顯著影響(p＞0.17),但添加錳

7、有降低FAS和MDH活性的趨勢(shì)。
　　 試驗(yàn)三研究不同水平及形態(tài)錳源對(duì)21～24日齡肉公雞原代培養(yǎng)肝細(xì)胞LDH的漏出、肝細(xì)胞中脂肪合成關(guān)鍵酶(FAS和MDH)活性及其基因表達(dá)的影響。試雞飼糧同試驗(yàn)二。試驗(yàn)采用2×2兩因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì),兩種錳源分別為中等絡(luò)合強(qiáng)度氨基酸錳(MnAA)和無(wú)機(jī)氯化錳,兩個(gè)錳添加水平分別為0.25 mM和0.5mM,兩種錳源共用一個(gè)不添加錳對(duì)照組,共組成5個(gè)處理組,各處理培養(yǎng)液培養(yǎng)肉仔雞肝細(xì)胞48h,每個(gè)

8、處理6個(gè)重復(fù),每只雞分離得到的肝細(xì)胞為一個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明:添加錳可顯著降低肝細(xì)胞[.DH的漏出、肝細(xì)胞中FAS和MDH mRNA的表達(dá)量(p＜0.0001)及FAS活性(p＜0.004):添加錳水平對(duì)肝細(xì)胞MDH mRNA的表達(dá)量(p＜0.02)有顯著影響,但添加錳源以及錳源與錳水平互作對(duì)肝細(xì)胞MDH mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著影響:添加錳源、錳水平以及錳源與錳水平互作對(duì)肝細(xì)胞LDH的漏出及肝細(xì)胞中FAS mRNA的表達(dá)量均無(wú)顯著影響(p＞