胰島素、高血糖素和神經(jīng)肽Y對初生犢牛原代培養(yǎng)肝細胞中硬脂酰CoA去飽和酶mRNA表達的影響.pdf

1、選用健康初生犢牛，采用雙灌流的方法，成功分離犢牛肝臟細胞，通過測定培養(yǎng)液中尿素合成能力、白蛋白分泌能力和乳酸脫氫酶的泄漏量等指標，檢測細胞在分離后損傷和修復(fù)情況，尋找神經(jīng)內(nèi)分泌激素處理的恰當(dāng)時機。以含有目的基因的質(zhì)粒為模板，采用梯度稀釋的方法，以S’YBR green I為熒光染料，檢測β-actin和SCD兩個基因的擴增效率。在培養(yǎng)到72h時，用0、5、10、20、501IJ/ml的胰島素，0、50、100、500、1000pg/ml

2、高血糖素，O、50、100、500、1000pg/ml神經(jīng)肽Y分別處理肝細胞，以β-actin為內(nèi)參基因，用熒光PCR方法檢測肝細胞內(nèi)硬脂酰CoA去飽和酶(SCD)mRNA的相對變化。 結(jié)果表明： 1.離體雙灌流法可以成功的分離犢牛肝細胞，成活率均在90％以上，細胞合成尿素的能力、分泌白蛋白的能力隨著培養(yǎng)時間先減少后增加，在培養(yǎng)到3～4天時乳酸脫氫酶泄漏明顯減少，表明培養(yǎng)3~4天后肝細胞能夠修復(fù)膠原酶帶來的損傷，因此分離

3、的肝細胞培養(yǎng)72h后，用作實驗材料比較適合。 2.通過質(zhì)粒濃度對數(shù)與CT值，求得Y=34.14-2.95<'*>X(Ⅰ)和Y=35.46-2.97<'*>X(Ⅱ)，兩個基因的擴展效率相同，可以用比較CT法計算SCDmRNA相對表達量。 3.胰島素能顯著的促進肝細胞內(nèi)SCDmRNA表達，不同濃度組間差異均顯著(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性促進效應(yīng)。 4.胰高血糖素顯著地抑制了肝細胞SCDmRNA表達水平，不同濃