團頭魴甘露糖受體CTLD4-8結(jié)構(gòu)域抗體制備及功能分析.pdf

1、甘露糖受體(MR, CD206)是甘露糖受體家族中最先發(fā)現(xiàn)的成員，它能夠識別多種內(nèi)源性和外源性甘露糖化配體，在宿主免疫和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。MR胞外有8個C-型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTLDs)，CTLD4-8結(jié)構(gòu)域有同等于完整的MR結(jié)合天然糖蛋白配體能力，能介導巨噬細胞對多種病原微生物的識別和吞噬。MR表達并不局限于巨噬細胞，在其他細胞如腎小球系膜細胞、淋巴和肝內(nèi)皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、成肌細胞以及腦中的小膠質(zhì)細胞等都發(fā)現(xiàn)有MR

2、表達。相對于哺乳動物MR的結(jié)構(gòu)、功能以及分布已有的詳盡研究，有關(guān)魚類MR的報道卻很少，尤其是MR蛋白的分布，迄今還沒有過報道。本研究從MR的CTLD4-8結(jié)構(gòu)域表達載體的構(gòu)建、原核表達、蛋白純化等方面入手，進而制備了抗團頭魴MR的多克隆抗體（MaMR-CTLD4-8）。結(jié)合免疫組化技術(shù)系統(tǒng)研究了MR蛋白在團頭魴胚胎期以及幼魚期各組織的分布，并研究了MR與GFP-E.coli的相互作用，探討其在團頭魴巨噬細胞吞噬病原微生物過程中發(fā)揮的作用

3、，以及引起的免疫應答。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)在優(yōu)化條件下，高效表達CTLD4-8重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定，證明成功表達了分子量大小為110kDa的融合蛋白;
　　(2)純化目的蛋白免疫日本大耳白兔三次，制備了多克隆抗體。ELISA檢測抗血清效價在51，200左右。以提取的團頭魴組織總蛋白作為蛋白樣品，經(jīng)Western-blot分析，在PVDF膜上檢測出單一條帶，分子量在170～180

4、kDa，與預測的MR大小相符。說明制備的多克隆抗體具有特異性，可用于下面的研究;
　　(3)利用免疫組化技術(shù)研究了MR蛋白在團頭魴胚胎期及幼魚各組織中的分布。結(jié)果表明MR首先出現(xiàn)在受精卵期的卵黃囊處，在出膜期分布廣泛。MR蛋白分布與早期巨噬細胞時空分布有一定關(guān)聯(lián)性，預測早期巨噬細胞就開始表達MR，而不是局限于終端分化巨噬細胞。MR廣泛表達于團頭魴頭腎、體腎、肝、腦、腸、鰓、肌肉和心臟等組織，而在脾中的表達很少，但是嗜水氣單胞菌感染