致病菌分子分型技術(shù)在食源性疾病暴發(fā)識別和溯源調(diào)查中的應(yīng)用

1、致病菌分子分型技術(shù)在食源性疾病暴發(fā)識別與溯源調(diào)查中的應(yīng)用,自貢CDC 微生物檢驗所 劉祥,,,,致病菌分子分型技術(shù),2,,,基于實驗室監(jiān)測作用,1,,2,5,基于實驗室監(jiān)測的定義,監(jiān)測是征對公共衛(wèi)生行動，系統(tǒng)而持續(xù)地收集、分析、解釋、反饋公共衛(wèi)生信息 基于實驗室監(jiān)測是征對公共衛(wèi)生行動，系統(tǒng)而持續(xù)地收集、分析、解釋、反饋實驗室確診病例信息,為什么要開展基于實驗室的監(jiān)測？,1、 確定病原體，同時進(jìn)行相應(yīng)的病原體分型

2、 2、 監(jiān)控每種病原體的變化趨勢時間趨勢（例如按照月、季度、年等）針對特定人群（例如腹瀉患者、嬰幼兒、孕婦等）,為什么要開展基于實驗室的監(jiān)測？,3、有助于有目的地制定病原體控制政策及措施4、提供確診病例信息以確定控制措施的有效性,基于實驗室監(jiān)測系統(tǒng),,,,,公共衛(wèi)生參比實驗室（疾控中心）,衛(wèi)生行政部門,,臨床實驗室1,臨床實驗室2,臨床實驗室3,臨床實驗室4,1、公共衛(wèi)生實驗室進(jìn)行分型發(fā)現(xiàn)病例聚集性 2、公

3、共衛(wèi)生實驗室必須與流行病學(xué)家分享分型結(jié)果 3、流行病學(xué)通過調(diào)查聚集性病例發(fā)現(xiàn)暴發(fā),,致病菌表型分型與分子分型的方法對比,,,1.表型和分子分型各有優(yōu)缺點(diǎn)；對于罕見血清型菌株，表型可發(fā)揮重要作用2.分子分型的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，各有適用性，聯(lián)合使用是主流3.實驗方法和結(jié)果的質(zhì)量保證是任何分析網(wǎng)絡(luò)的最關(guān)鍵部分,為什么要做分子分型？,,,比較分型法 PFGE 核糖體分型 短期傳播 局部區(qū)域暴發(fā)菌株克隆相關(guān)性 文庫分型法

4、 MLST 核糖體分型 16S rRNA基因測序 種群進(jìn)化 研究地域性傳播和流行性變遷,并不矛盾，相互補(bǔ)充,綜合手段,重點(diǎn)介紹以下幾種分子分型方法,16S rRNA基因測序分型 PFGE（脈沖場凝膠電泳分型）MLST（多位點(diǎn)測序分型）,（一） 16S rRNA基因測序,RNA,mRNAtRNArRNA,mRNA功能：把細(xì)胞核內(nèi)DNA的堿基順序，按照堿基互補(bǔ)的原則，抄錄并轉(zhuǎn)送至細(xì)胞質(zhì),在蛋

5、白質(zhì)合成中用以翻譯成氨基酸的排列順序。tRNA功能:在細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過程中作為各種氨基酸的載體，并將各種氨基酸專呈給mRNA。rRNA ：核蛋白體RNA，與核蛋白共同構(gòu)成核蛋白體，即核糖體。原核生物的rRNA有5s、16s、23s三種；真核生物有18s、5s、5.8s和28s。,核糖體RNA,蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成原核生物核糖體（70S) 小亞基(30S)

6、 大亞基(50S） 小亞基(30S) 16S rRNA(1542個核苷酸)（PCR擴(kuò)增大小合適） 蛋白質(zhì)(21種）大亞基(50S） rRNA 5S， 120個核苷酸

7、 23S，2940個核苷酸 蛋白質(zhì)(31種）,,,,,分子標(biāo)志－16S rRNA,存在于所有原核生物的細(xì)胞中，并執(zhí)行相同的功能保守區(qū)域幾乎與所有種屬的核糖體靶位點(diǎn)結(jié)合異質(zhì)性區(qū)域變異程度不能區(qū)分親緣關(guān)系接近的細(xì)菌具有分子計時器的特點(diǎn)，分子序列變

8、化緩慢，能跨越整個生命進(jìn)化過程分子中含有進(jìn)化速度不同的區(qū)域，可用于進(jìn)化程度不同的生物之間的系統(tǒng)發(fā)育研究——進(jìn)化樹,,16S rRNA序列分型,16S rRNA基因圖特征,,鏈球菌屬16S rRNA序列分型,（二） 脈沖場電泳技術(shù) （PFGE）,目前分子分型“金標(biāo)準(zhǔn)”敏感、特異、重復(fù)性高、分辨率高征對整條染色體分型,PFGE,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,細(xì)菌的染色體,稀有酶切位點(diǎn),限制性內(nèi)切酶消化,電泳,,,,,

9、費(fèi)用：100元/菌株,,,,,,,,,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,Electric Field 1,Electric Field 2,,Switch Time,CHEF,,,,,,,,,,,,,,,,動物、肉類和人的多重耐藥Newport沙門菌分離株的PFGE圖譜,,,,,,已開展PFGE的菌種,非傷寒沙門菌傷寒與甲型副傷空腸彎曲菌單增李斯特菌志賀菌大腸桿菌O157霍亂弧菌,腦膜炎奈瑟氏菌

10、布魯氏菌豬鏈球菌鏈球菌,食源性,非食源性,（三）多位點(diǎn)序列測定（Multi-Locus Sequence Typing，MLST）,分型的基礎(chǔ)：細(xì)菌基因組內(nèi)位于同一位點(diǎn)的看家基因的片段是否存在變異看家基因的測序不同的等位基因指派一定的數(shù)值，生成等位基因譜 每個等位基因譜認(rèn)定為一個序列型（ST） 進(jìn)化樹確定親緣關(guān)系,MLST,可以用于暴發(fā)調(diào)查種群生物學(xué)分析，特別適合于分離株有足夠時間進(jìn)行分化的全球流行病學(xué)