狂犬病毒基礎(chǔ)知識及生產(chǎn)工藝

1、狂犬病毒基礎(chǔ)知識及疫苗生產(chǎn)工藝,2016年04月,目錄,狂犬病病毒歸屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae），病毒形態(tài)是一端平坦或略凹狀，另 一端為半原形，酷似子彈，故得名彈狀病毒，病毒大小75*175nm經(jīng)組織培養(yǎng)后，病毒的形態(tài)多呈兩端平坦狀的顆粒。單鏈RNA病毒.,狂犬病毒的特點,,狂犬病毒形狀,狂犬病病毒電鏡照片,狂犬病毒對外界的抵抗力很弱，對溫度敏感，60 ℃30~60min，100℃ 2min即可滅活。病毒對陽光、紫外線敏

2、感，各 種常見的消毒劑如肥皂水、碘酒、3%來蘇爾、75%酒精等均可使其滅活。 抗生素對其卻無滅活作用。,狂犬病毒的特點,狂犬病病毒最大的特點是對神經(jīng)組織的嗜性遠遠大于其他組織。在神經(jīng)組織內(nèi)病毒復(fù)制的比率遠比在其他組織內(nèi)高。,狂犬病毒的特點,1、狂犬病毒形狀為子彈形，一端為橢圓形，另一端平整。2、狂犬病毒具有嗜神經(jīng)性，主要在中樞神經(jīng)內(nèi)繁殖。3、狂犬病毒最初進入傷口時，不進入血液循環(huán)，而是在被咬傷的肌肉組織中復(fù)制，然后侵入神經(jīng)系統(tǒng)。

3、4、狂犬病毒在神經(jīng)軸中的移動速度約5~100mm/天，如一定范圍內(nèi)（10um-2cm）的軸突同時受感染，病毒移行速度甚至?xí)臁?狂犬病毒的特點,野生動物與家畜是狂犬病的傳染源。人類狂犬病由狗、貓直接傳染者占90%以上，其次為牛（主要是水牛）、豬、兔、馬、驢騾以及野生動物。,狂犬病毒的宿主動物,狂犬病致病機理,一般 20 – 60 天從暴露后數(shù)天到數(shù)年，差別非常大主要的影響因素,感染的病毒數(shù)量 感染的病毒株 暴露的嚴重程度

4、 暴露的部位,一般20 - 60天 1月內(nèi)發(fā)病71% 3月內(nèi)發(fā)病87%,潛伏期,人用狂犬病疫苗發(fā)展史,1882年，巴斯德成功在牛腦中分離到狂犬病毒株，并在兔腦內(nèi)連續(xù)傳90代，成為固定毒。1885年，巴斯德嘗試研制減毒活疫苗1911年，Semple在巴斯德的研究基礎(chǔ)上，研制出腦組織滅活疫苗；1956年，Peck研究制備鴨胚疫苗（DEV）。該疫苗在美國和其他國家用作狂犬病暴露后處理并廣泛使用了27年，很少觀察到嚴重的副作用，但中

5、和性抗體水平不如腦組織疫苗。1964年，美國研制出人二倍體細胞疫苗，并于1978年開始商品化，目前在美國、加拿大、大多數(shù)歐洲國家和幾個亞洲國家使用。1984年由法國Merieun研究所研制成功Vero細胞疫苗,國外疫苗發(fā)展史,國內(nèi)疫苗發(fā)展史,1949年，羊腦組織疫苗1980年，原代地鼠腎細胞疫苗（淡苗）之后經(jīng)歷了濃縮苗、精致苗、無佐劑純化苗90年代，引進Vero細胞疫苗2005年6月30日，無佐劑疫苗,人用狂犬疫苗生產(chǎn)工藝,

6、,原始種子（3aG4）→豚鼠腦內(nèi)傳代（3aG 5）→地鼠腎細胞傳代（4aG ）→豚鼠腦內(nèi)傳2代（ 4aG2）→建立主代毒種庫主代毒種庫（ 4aG2）→豚鼠腦內(nèi)傳1代（ 4aG3） →建立主工作毒種庫,毒種制備工藝：,毒種制備工藝：,地鼠→消毒、解剖、取腎、消化→細胞制備→接種病毒→洗換→收獲病毒液→滅活病毒→超濾濃縮→純化→半成品配制→洗瓶、灌裝、軋蓋→目檢→包裝→入庫,地鼠的挑揀清洗：純化水4~6遍，注射用水3遍消毒：2%甲醛溶

7、液2遍，0.1%新潔爾滅2遍解剖：扒皮、剪肌、取腎洗腎：消化：0.1%胰蛋白酶每對腎加入3~4ml，置2~8℃消化15~18小時。,解剖消化工藝,地鼠消毒,解剖地鼠,培養(yǎng)液配制：Hanks’ 液＋營養(yǎng)液＋小牛血清＋硫酸慶大霉素細胞制備：棄去消化液，洗滌腎塊，搖振分散細胞，反復(fù)收集數(shù)次。細胞培養(yǎng)：37±1℃培養(yǎng)90-100小時,細胞制備工藝,細胞培養(yǎng),地鼠腎細胞,細胞觀察毒種配制接種培養(yǎng)吸附： 34±1

8、℃ 培養(yǎng)吸附18-24小時,接種病毒工藝,維持液配制：199＋0.2~0.4%人血白蛋白＋碳酸氫鈉洗滌細胞換維持液病毒培養(yǎng)： 34±1℃ 培養(yǎng)96～120小時,洗換工藝,細胞觀察收獲病毒液：收獲標準加液：加維持液取樣檢定保存：收獲液置2~8℃保存、待檢；細胞瓶置34±1℃ 繼續(xù)培養(yǎng)96～120小時,多次收獲病毒液、加液工藝,收獲液檢查無菌轉(zhuǎn)入加滅活劑：終濃度甲醛溶液250µg/ml 滅活

9、過程：滅活罐內(nèi)混勻，于34℃±1℃恒溫滅活18～20小時 取樣檢定,病毒滅活工藝,采用截留分子量為300KD的濾膜超濾濃縮至蛋白質(zhì)含量在2000～3000µg/ml范圍內(nèi)（濃縮倍數(shù)為50±10倍）按照病毒收獲液體積的0.3～0.6倍的滅菌PBS對濃縮液進行分段洗濾,超濾濃縮工藝,濃縮液離心層析介質(zhì)為瓊脂糖凝膠Sepharose 4FF 純化：以pH 7.5的PBS洗脫，洗脫液流速240～280ml/

10、分鐘，280nm紫外檢測,收集第一峰。取樣檢定,純化工藝,配方計算：抗原含量≥4.5IU/ml，蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于80µg/ml 配制：將純化后原液及終濃度為1%的人血白蛋白、40µg /ml的硫柳汞 轉(zhuǎn)入合并罐內(nèi)混勻。取樣,配制工藝,西林瓶清洗、滅菌：經(jīng)超聲波清洗后350℃ 5分鐘干熱滅菌 分裝：疫苗每支裝量不少于標示量 軋蓋：通過傳輸帶傳至軋蓋間，自動上機進行加蓋封口 。,灌裝工藝,外觀檢查：雙眼平視西

11、林瓶，首先檢查裝量是否準確；再移至目檢臺黑、白色底板處檢查是否有異物。,目檢工藝,包裝規(guī)格:小盒：5瓶/人份中盒：10人份/盒大箱：120人份/箱,包裝工藝1,包材噴印 按包裝指令上內(nèi)容對小盒、中盒、大箱、合格證進行調(diào)試印制，“產(chǎn)品批號”、“生產(chǎn)日期”及“有效期至”印制位置適中，字體應(yīng)清晰。包裝前核對 對所有包材印制“產(chǎn)品批號”、“生產(chǎn)日期”及“有效期至”內(nèi)容的核對應(yīng)與包裝指令內(nèi)容一致無誤。,包裝工藝2,裝盒：將計數(shù)

12、后西林瓶逐一進行標簽印制貼附；取5只貼簽后西林瓶裝入白色盒托，上放一份說明書裝入小盒，貼上封口簽；取10小盒裝入一中盒，貼上封口簽；取12中盒裝入一大箱。最后放一張產(chǎn)品合格證進行封箱捆扎轉(zhuǎn)入2～8℃冷庫整齊擺放。,包裝工藝3,電子監(jiān)管碼生成及貼附 對10小盒產(chǎn)品進行一級電子條碼掃描生成一個二級條碼貼附在對應(yīng)的中盒包裝指定位置；對12中盒產(chǎn)品進行二級電子條碼掃描生成兩個三級條碼貼附在對應(yīng)的大箱包裝指定位置。,包裝工藝4,1、外觀：

13、依法進行檢查，結(jié)果為無色澄明液體，無異物。2、裝量：依法進行裝量檢查，應(yīng)不低于標示量1.0ml/劑。3、化學(xué)檢定（1）pH值：依法進行檢測，pH值應(yīng)為7.2～8.0。（2）硫柳汞含量：依法進行硫柳汞含量檢測，結(jié)果應(yīng)為30～50µg/ml。（3）游離甲醛含量：依法進行游離甲醛含量檢測，結(jié)果不得高于40µg/ml。,成品檢定,4、效價測定：依法檢查，放行標準應(yīng)不低于4.0IU/劑。有效期內(nèi)標準應(yīng)不低于2.5IU

14、/劑。 5、熱穩(wěn)定性試驗：疫苗出廠前應(yīng)進行熱穩(wěn)定性試驗。于37℃放置14天后依法進行效價測定，應(yīng)不低于2.5IU/劑。 6、牛血清白蛋白殘留量測定：依法進行牛血清白蛋白殘留量測定，結(jié)果應(yīng)不高于50ng/劑。,成品檢定,成品檢定,7、抗生素殘留量測定：依法進行硫酸慶大霉素殘留量測定，結(jié)果應(yīng)不高于50ng/劑。8、地鼠腎細胞蛋白質(zhì)殘留量測定：依法進行地鼠腎細胞蛋白質(zhì)殘留量測定，結(jié)果應(yīng)不高于24µg/劑。9、無菌檢查：依法進