基于狂犬病毒標記神經(jīng)環(huán)路單細胞測序系統(tǒng)的建立及應(yīng)用.pdf

1、狂犬病毒是一種致死性的神經(jīng)嗜性病原微生物，由于其很高的致死率以及目前缺乏很好的防治方法，對人類和相關(guān)宿主動物的健康造成了巨大的威脅，也因此成為了病原學(xué)中一個很重要的研究對象。另一方面因其具有對神經(jīng)元的特殊嗜性以及在神經(jīng)元內(nèi)生存和復(fù)制的能力，狂犬病毒被開發(fā)成為了一種用來神經(jīng)環(huán)路示蹤和標記的有力工具，相對于傳統(tǒng)的神經(jīng)環(huán)路示蹤工具有著天然優(yōu)勢，在神經(jīng)科學(xué)的研究中具有巨大的應(yīng)用價值和開發(fā)潛力。單細胞測序技術(shù)作為近幾年發(fā)展起來的新型技術(shù)，憑借其獨

2、有的優(yōu)勢為現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展起到了巨大的推動作用，通過對單個細胞組學(xué)相關(guān)信息的分析實現(xiàn)在細胞和分子層析探索相關(guān)生物學(xué)過程以及復(fù)雜組織的結(jié)構(gòu)和功能的解析，在發(fā)育、癌癥以及神經(jīng)科學(xué)等研究領(lǐng)域具有不可替代的應(yīng)用潛力。
　　大腦，作為目前動物體中結(jié)構(gòu)和功能最復(fù)雜的器官，已成為現(xiàn)在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最熱門也最有挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域，對其深入的研究和探索對理解大腦運行機制以及對相關(guān)腦疾病的防治提供理論意義和指導(dǎo)作用。而對于大腦奧秘的揭示，最重要的一

3、步是對其中數(shù)量龐大而又錯綜復(fù)雜神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能的解析。
　　于是，基于以上相關(guān)技術(shù)和科學(xué)背景，本課題主要的目的是利用狂犬病毒對特異神經(jīng)環(huán)路進行示蹤和標記，描繪對應(yīng)神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時結(jié)合單細胞測序技術(shù)對標記的特異神經(jīng)環(huán)路上的神經(jīng)元進行單細胞水平上的轉(zhuǎn)錄組分析，分析對應(yīng)神經(jīng)環(huán)路的功能基礎(chǔ)。從而實現(xiàn)對特定神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能的解析，為進一步深入探索神經(jīng)環(huán)路的調(diào)節(jié)機制以及在受到外界病原入侵時如何變化提供科學(xué)基礎(chǔ)和研究思路。本課題的研

4、究內(nèi)容主要分為以下幾個方面:
　　1.片段化酶Tn5的純化和應(yīng)用
　　Tn5是來源于大腸桿菌中一種轉(zhuǎn)座酶，由于其在體外可以轉(zhuǎn)座以及對DNA片段進行切割和連接接頭的能力被開發(fā)為二代測序文庫構(gòu)建時用于片段化和接頭化的工具酶，并在單細胞測序文庫構(gòu)建中具有很廣泛的應(yīng)用價值。在該課題中，我們首先對其進行了表達、純化和組裝。其次對其進行了活性檢測，驗證了Tn5具有DNA片段化和加接頭的能力。最后我們經(jīng)過不斷優(yōu)化反應(yīng)條件將其成功應(yīng)用到單細

5、胞轉(zhuǎn)錄組測序Smart-seq2建庫方法中，節(jié)省建庫成本的同時又可以進行特殊功能應(yīng)用的擴展。
　　2.Smart-seq2技術(shù)在培養(yǎng)細胞和特異神經(jīng)環(huán)路神經(jīng)元上的應(yīng)用
　　Smart-seq2技術(shù)是目前最常用的單細胞RNA-seq技術(shù)，我們首先通過不斷地嘗試和摸索將其應(yīng)用到培養(yǎng)的細胞上，做到了個位數(shù)細胞起始量的轉(zhuǎn)錄組擴增。然后結(jié)合狂犬病毒對特異神經(jīng)環(huán)路神經(jīng)元的標記和分離技術(shù)，將其應(yīng)用到特異神經(jīng)環(huán)路神經(jīng)元上，完成了對神經(jīng)環(huán)路單個

6、神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組的建庫測序和數(shù)據(jù)分析，從而實現(xiàn)對感興趣的特定神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)的解析和功能的探索。
　　3.PVN-LHA神經(jīng)環(huán)路的標記和初步探索
　　PVN是下丘腦中具有調(diào)節(jié)機體相關(guān)自主性的生理功能作用的神經(jīng)核團，PVN-LHA神經(jīng)環(huán)路對于機體飲食的調(diào)節(jié)起著直接的影響，對其深入的研究可以理解大腦對飲食行為的調(diào)節(jié)機制以及在受到病原入侵時的響應(yīng)。本課題中，我們首先利用GFP重組的狂犬病毒對PVN-LHA環(huán)路進行了標記，然后對在PVN處標

7、記的神經(jīng)元進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒?。我們分析了這些神經(jīng)元的基因表達譜，并對神經(jīng)元類型和功能相關(guān)的基因表達情況做了免疫組化方面的驗證，為進一步深入研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　總體而言，本課題結(jié)合狂犬病毒對特異神經(jīng)環(huán)路的示蹤標記技術(shù)和單細胞RNA-seq技術(shù)，實現(xiàn)了在特定神經(jīng)環(huán)路上神經(jīng)元單細胞轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)的建立，并將其應(yīng)用到PVN-LHA神經(jīng)環(huán)路，初步鑒定了該環(huán)路PVN處神經(jīng)元的類型和功能，為進一步研究此環(huán)路提供了一定的技術(shù)，而且這