菌種管理 ppt課件

1、,菌 種,,基本概念：標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國內(nèi)或國際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。,菌種 — 菌種保藏的概念,,菌種保藏機(jī)構(gòu)目前

2、﹐世界上約有 550個菌種保藏機(jī)構(gòu)。國外的菌種保藏機(jī)構(gòu)：世界菌種保藏聯(lián)合會(WFCC)美國菌種保藏中心(ATCC)美國農(nóng)業(yè)部“北部地區(qū)研究實驗室” (NRRL)英國“國立標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所” (NCTC)英國“國際真菌研究所” (CMI)荷蘭“真菌中心保藏所” (CBS)日本微生物菌種保藏聯(lián)合會(JFCC),菌種 — 菌種保藏的概念,,我國的菌種保藏機(jī)構(gòu)普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(

3、ACC)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心(CMCC)抗菌素菌種保藏管理中心(CACC)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CFCC)專利微生物菌種保藏管理中心,菌種 — 菌種保藏的概念,,《中國藥典》2015年版實驗室認(rèn)可準(zhǔn)則其他行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),菌種 — 菌種保藏和使用的法規(guī),,中國藥典2015年版藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則中對菌種有了較為明確的規(guī)定允許使用標(biāo)

4、準(zhǔn)菌株和商業(yè)派生菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)按保藏機(jī)構(gòu)提供的說明進(jìn)行復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株,菌種 — 菌種保藏和使用的法規(guī),,菌種保存的原理是根據(jù)菌種的生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞基

5、本上處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。因此低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。,菌種 — 菌種保存的原理,,選擇適宜的培養(yǎng)基﹑培養(yǎng)溫度和菌齡﹐以便得到健壯的細(xì)胞或孢子﹔保存于低溫﹑隔氧﹑干燥﹑避光的環(huán)境中﹐盡量降低或停止微生物的代謝活動﹐減慢或停止生長繁殖﹔不被雜菌污染﹐在較長時期內(nèi)保持著生活能力。,菌種 — 菌種保藏的要點,,菌種保存方

6、法有多種，如瓊脂斜面低溫保存法、液體石蠟保存法、干燥（沙土）保存法、冷凍真空保存法、濃氮超低溫保存法等。但對不同的微生物應(yīng)通過保存試驗來選擇最適宜的保存方法。注意事項：保存的菌種均應(yīng)是新鮮純菌培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。不同細(xì)菌用不同培養(yǎng)基，定期檢查菌種保存環(huán)境做好記錄。,菌種 — 菌種保藏的方法,,瓊脂斜面低溫保存法：此方法是實驗室菌種最常用的保存方法，具有操作簡便，使用方便的優(yōu)點。具體方法是：用無菌的接種環(huán)挑取菌株一環(huán)，劃線

7、于適宜的瓊脂斜面（細(xì)菌為營養(yǎng)瓊脂斜面、真菌為改良馬丁瓊脂斜面）上，細(xì)菌置37℃培養(yǎng)18~24小時，真菌置25℃培養(yǎng)18~24小時。,菌種 — 菌種保藏的方法,,礦油封藏法： 將化學(xué)純的液體石蠟(礦油)經(jīng)高壓蒸氣滅菌﹐放在40℃恒溫箱中蒸發(fā)其中的水分﹐然後注入斜面培養(yǎng)物中﹐使液面高出斜面約 1厘米。將試管直立﹐放在15-20℃室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體﹐既能隔絕空氣﹐又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥﹐可以延長菌種保藏的時間

8、。但注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶﹑對菌種無毒﹐不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌﹑芽孢桿菌﹔不適用于固氮菌﹑乳酸桿菌﹑明串珠菌﹑法門氏菌和毛黴目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行﹐但必須注意防火和污染,菌種 — 菌種保藏的方法,,甘油冷凍管保存法：用無菌接種環(huán)挑取菌種接種在相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基斜面上，置適宜的培養(yǎng)條件培養(yǎng)后，加入含0.05%聚山梨脂80的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基3~5ml，并通過接種環(huán)輕輕刮取菌苔，使細(xì)菌充分?jǐn)U散，制成菌懸液，再加入

9、等體積的、濃度為20%的無菌甘油溶液，輕輕振搖，最后分裝于無菌小試管中，置-30℃條件下保存，-80℃保存效果更佳,菌種 — 菌種保藏的方法,,此法應(yīng)注意菌懸液的濃度應(yīng)高一些，另外甘油的濃度不宜過高，否則影響細(xì)菌細(xì)胞滲透壓，引起細(xì)菌死亡。厭氧菌不宜用此法保存。,菌種 — 菌種保藏的方法,,沙土管法：將沙或土過篩﹑烘干﹑裝管﹑滅菌﹑然後將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分﹐干燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在干

10、燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態(tài)﹐可保存較長時期。此法適用于芽孢桿菌﹑梭狀芽孢桿菌﹑放線菌﹑鐮刀菌等。,菌種 — 菌種保藏的方法,,冷凍真空干燥法：將細(xì)胞懸液每0.1-0.2毫升注入一無菌安瓿瓶﹐于-40℃預(yù)凍1小時﹐再于-20-30℃﹑真空度為13.3帕的條件下脫水。在脫水過程後期﹐安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水後的樣品含水量應(yīng)在 3％以下。最後﹐將安瓿瓶保持真空度 1.3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。為防止細(xì)胞在凍結(jié)和脫水過

11、程中損傷或死亡﹐要用保護(hù)劑制備細(xì)胞懸液。保護(hù)劑有脫脂牛奶﹑血清﹑10％蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通過氧和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。此法適用于病毒﹑衣原體﹑枝原體﹑細(xì)菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌等的長期保存﹐是當(dāng)前保藏菌種的一個重要方法。但是﹐鹽桿菌﹑發(fā)光桿菌﹑黏桿菌﹑阿舒囊黴﹑多囊黴﹑擔(dān)子菌中的大多數(shù)屬種不適用于此法保存。,菌種 — 菌種保藏的方法,,液態(tài)氮超低溫凍結(jié)法： 用甘油或二甲亞砜(DMSO)作保護(hù)

12、劑制備細(xì)胞懸液﹐分裝入無菌安瓿瓶﹐每管0.2毫升﹐在控制溫度下降速率為1℃/分鐘的條件下預(yù)凍至-40℃﹐然後立即放入液氮生物貯存罐中氣相(-150℃)保存。恢復(fù)培養(yǎng)時﹐先直接侵入38℃水浴中解凍 5～10分鐘﹐再種植于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。這是根據(jù)在低于-130℃時一切生化反應(yīng)處于停止?fàn)顟B(tài)﹑微生物也不能進(jìn)行代謝活動而設(shè)計的凍結(jié)法。為避免凍死﹑凍傷和細(xì)胞內(nèi)形成大量冰晶﹐用保護(hù)劑制備懸液并控制預(yù)凍時的冷卻速率和解凍時融化速率。微生物的大多數(shù)屬種

13、適于慢速凍結(jié)和快速解凍。此法適用于病毒﹑枝原體﹑各種細(xì)菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌﹑藍(lán)藻等。,菌種 — 菌種保藏的方法,,實驗室常用的菌種保存方法：保存媒介：甘油冷凍管瓊脂斜面培養(yǎng)基瓷珠保存管保存溫度：甘油冷凍管和瓷珠保存管均在-30℃或-80℃ 瓊脂斜面培養(yǎng)基在4~8℃,菌種 — 菌種保藏的方法,,菌種的申購菌種的復(fù)蘇菌種的傳代菌種的保藏菌種的使用和銷毀,菌種 — 菌種管理,,菌種的申購每年年底，由實驗室菌種管

14、理人員提出下一年度菌種采購的計劃，計劃購置的菌種一般為藥典收載的標(biāo)準(zhǔn)菌種，填寫請購單，經(jīng)批準(zhǔn)后，由所采購部門向指定的菌種保藏機(jī)構(gòu)購置。所購菌種均為冷凍干燥菌種。 采購部門購入菌種后，應(yīng)及時移交實驗室。實驗室菌種管理人員應(yīng)仔細(xì)核對菌種發(fā)放單和冷凍干燥菌種管標(biāo)簽等各項信息，確認(rèn)無誤后，置4-6℃暫存。,菌種 — 菌種管理,,菌種的復(fù)蘇：培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 (SDB)；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基

15、 (TSA)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)；梭菌增菌培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度：細(xì)菌：30~35℃真菌：20~25℃,菌種 — 菌種管理,,菌種 — 菌種管理,菌種復(fù)蘇：操作流程,,菌種的確認(rèn): 劃線于選擇性培養(yǎng)基革蘭氏染色適宜的生化實驗全自動微生物鑒定儀工作用菌種的制備：選擇性培養(yǎng)基上的典型菌落分別劃線于相應(yīng)的瓊脂斜面上,菌種 — 菌種的確認(rèn)及工作用菌株的制備,,稀釋液：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無

16、菌氯化鈉溶液黑曲霉：含0.05%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液。稀釋方式：10倍遞增稀釋菌液制備后：室溫下放置，應(yīng)在2小時內(nèi)使用；2~8 ℃可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉的孢子液可保存在2~8 ℃ ，可在驗證過的儲存期內(nèi)使用。,菌種 — 試驗用菌液的制備,,1）標(biāo)準(zhǔn)菌種的申購記錄；2）從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作及記錄；3）菌種必須定期轉(zhuǎn)種傳代，并做純度、特性等實驗室所需關(guān)鍵指標(biāo)的確認(rèn)，并記