前列腺癌方面免疫組化基礎(chǔ)知識(shí)

1、前列腺癌的免疫組化標(biāo)記物,發(fā)表時(shí)間：2013-5-13 來源：《中外健康文摘》2013年第10期供稿 作者：胡新梅 于民 姜敏,,1 前列腺特異性抗原前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)是分子量34000的單鏈糖蛋白，由237個(gè)氨基酸構(gòu)成，它是一種絲氨酸蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是在1979年作為前列腺腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)的。血清PSA目前已被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的早期篩查。

2、,PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤，均呈陽性表達(dá)，定位于上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中，而在前列腺轉(zhuǎn)移癌則呈陰性表達(dá)，因此PAS陽性提示腫瘤來自前列腺上皮，可用于區(qū)分前列腺癌與前列腺轉(zhuǎn)移癌[5]。PSA在前列腺良、惡性病變中均呈陽性表達(dá)，故PSA不能用于鑒別良惡性病變。幾乎所有的前列腺癌（除了分化最差的癌和少數(shù)激素治療后復(fù)發(fā)的進(jìn)展期癌以外）PSA標(biāo)記都陽性，而高分化前列腺癌的PSA表達(dá)強(qiáng)于低分化前列腺癌, 表明PSA表達(dá)與分化

3、程度有關(guān)。而對(duì)于分化很差的癌，即使PSA陰性也不能完全排除前列腺癌，還要結(jié)合其他檢查綜合考慮。偶爾PAS陽性可出現(xiàn)在前列腺以外的組織和腫瘤，但一般為局灶性弱陽性 [6]。,,[5]Harvey AM, Grice B, Hamilton C, et a1. Diagnostic utility of p504s/p63 cocktail, prostate-specific antigen, and prostatic acid ph

4、osphatase in Verifying prostatic carcinoma involvement in seminal Vesicles: a study of 57 cases of radical prostatectomy, speciments of pathologic stage pT3b[J]. Arch Pathol Lab Med,2010,134(7):983-988.[6]Bostwick D G

5、, Qian J, Ramnani D M. Immunohistochemistry of the prostate and bladder, testis and renal tumors. In: Dabbs D J, ed. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2002.407-33,CK34βEl2,1984年，Gown等[

6、7]首先報(bào)道了CK34βEl2，它是一種高分子量57000～66000的細(xì)胞角蛋白。CK34βEl2標(biāo)記良性前列腺組織，僅在前列腺基底細(xì)胞的細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而不在前列腺分泌上皮細(xì)胞表達(dá)，故CK34βEl2可作為對(duì)前列腺的基底細(xì)胞層進(jìn)行選擇性的標(biāo)記[8]。由于基底細(xì)胞消失是診斷前列腺癌的重要形態(tài)學(xué)依據(jù)，而蘇木素-伊紅染色切片判斷基底細(xì)胞是否存在常十分困難，因此用CK34βEl2標(biāo)記基底細(xì)胞就成為前列腺良惡性鑒別診斷的重要手段之一。

7、,在正常和良性增生以及上皮內(nèi)瘤的前列腺腺體，導(dǎo)管周圍形成連續(xù)或斷續(xù)的CK34βE12分布。而前列腺癌的腺體的基底細(xì)胞層完全消失，所以最終表現(xiàn)為CK34βE12不表達(dá)。但CK34βE12標(biāo)記基底細(xì)胞可部分陰性，對(duì)經(jīng)尿道電切的標(biāo)本，常因標(biāo)本經(jīng)人為燒灼而受影響，因此可靠性和穩(wěn)定性欠佳。有20%～30%的前列腺癌導(dǎo)管腺癌和篩狀癌周圍有連續(xù)或間斷的基底細(xì)胞，而部分良性前列腺病變,如腺病和不完全性萎縮的腺泡周圍基底細(xì)胞可部分甚至完全消失。說明基底細(xì)

8、胞消失并非診斷前列腺癌的絕對(duì)指標(biāo)。而免疫組化操作不當(dāng)，則有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果而誤診。故免疫組化結(jié)果應(yīng)結(jié)合HE切片中的其他形態(tài)學(xué)特征綜合判斷。,P63,1998年，Okada等[9]分離出新基因P63，P63是P53抑癌基因家族的成員，位于人類染色體3q27-29。P63能特異性地標(biāo)記前列腺基底細(xì)胞，呈胞核陽性，棕黃色顆粒狀，故而可以顯示基底細(xì)胞的存在，而前列腺的分泌上皮細(xì)胞則呈陰性[10]。絕大多數(shù)的前列腺良性增生及低級(jí)別上皮內(nèi)瘤的腺體

9、的周圍呈現(xiàn)連續(xù)性的P63分布；而高級(jí)別上皮內(nèi)瘤可見P63不同程度的間斷消失，而前列腺癌中腺體周圍P63為陰性，顯示基底細(xì)胞已經(jīng)完全的消失。因此，P63也可用于前列腺癌的鑒別診斷。,,CK34βE12、P63均可用于標(biāo)記基底細(xì)胞，而作為診斷前列腺癌的有力手段。P63與CK34βEl2相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①部分CK34βE12標(biāo)記陰性的基底細(xì)胞，P63標(biāo)記可呈陽性；②對(duì)有燒灼的經(jīng)尿道電切的前列腺標(biāo)本，P63標(biāo)記結(jié)果比較穩(wěn)定。③P63標(biāo)記基底

10、細(xì)胞呈核陽性，結(jié)果容易判斷，背景比較清晰。缺點(diǎn)則是其陽性表達(dá)是間斷的，當(dāng)可疑腺泡少時(shí)，判斷其基底細(xì)胞是否消失有時(shí)比較困難。在實(shí)際應(yīng)用中，兩者具有互補(bǔ)作用。,,基底細(xì)胞消失是前列腺癌的重要診斷依據(jù)，但局部的基底細(xì)胞缺失卻不能作為診斷前列腺癌的唯一標(biāo)準(zhǔn)。由于前列腺癌可有殘留的基底細(xì)胞，而且浸潤(rùn)性癌在管腔內(nèi)擴(kuò)散及良性腺體陷入癌組織中[11],因此個(gè)別前列腺癌中CK34βEl2與P63亦有陽性表達(dá)。少數(shù)前列腺增生病變基底細(xì)胞標(biāo)記亦呈陰性表達(dá)，說

11、明少數(shù)前列腺良性腺體基底細(xì)胞可以不連續(xù)或不能被證實(shí)存在，這也提示基底細(xì)胞免疫標(biāo)志物陰性不能單獨(dú)作為確診惡性的指標(biāo)。,α-甲基-輔酶A-消旋酶 (P504s),2001年Jiang等[12]首次將P504s抗體應(yīng)用于前列腺癌的診斷。P504s即α-甲基-輔酶A-消旋酶((alpha-methylacyl-CoA racemase)，其基因定位于染色體5P13，它所編碼的蛋白由382個(gè)氨基酸組成，在支鏈脂肪酸的β-氧化和衍生過程中起作用。P

12、504s在前列腺癌中高表達(dá)，而在正常中前列腺組織中則呈陰性或灶性弱陽性。Jiang等在所檢測(cè)的137例前列腺癌中陽性率高達(dá)100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特異性的標(biāo)記物。,,P504s陽性，CK34βEl2和p63陰性，能從正反兩面支持前列腺癌診斷，從而大大提高前列腺癌的診斷正確率[13]。然而，臨床上并非所有的前列腺癌都是P504s陽性，CK34βEl2及p63陰性，也并非所有的前列腺良性病變都是P504s陰性，CK3

13、4βEl2及p63完整陽性。楊京哲[14]等人的試驗(yàn)中，P504s不僅在前列腺癌中有高表達(dá)，而且在前列腺上皮內(nèi)瘤中也高表達(dá)，這表明P504s不但對(duì)前列腺癌敏感，并且對(duì)PIN也非常敏感，故用P504s只能區(qū)別前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN鑒別開來。,,2004版 WHO中， P504s在前列腺癌的陽性率為80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫狀腺癌、萎縮性癌、假增生性癌和治療后前列腺癌中陽性率比較低。而且P504s在12%的良性增生

14、，17.5%的前列腺腺病，萎縮型腺體以及90%以上的高級(jí)別PIN中呈陽性反應(yīng)。此外，P504s在前列腺以外的腫瘤如尿路上皮癌、結(jié)腸癌、腎癌以及良性腎源性腺瘤也可陽性。這表明P504s沒有組織特異性，不是前列腺癌的特異性標(biāo)志物。,,綜上所述，免疫組化在前列腺癌診斷中的應(yīng)用具有重要價(jià)值，但決不能完全依靠免疫組化去診斷前列腺癌，單獨(dú)的P504s(或基底細(xì)胞標(biāo)志物)陽性或陰性均不能確診前列腺癌。只有將組織病理形態(tài)與免疫組化染色結(jié)果結(jié)合起來，全面

15、分析，綜合判斷，才能有效地避免誤診。,免疫酶細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)---實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸技術(shù)（周德山）,免疫酶細(xì)胞化學(xué)是免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry,ICC）中最常用的方法之一，它是在抗原抗體特異反應(yīng)存在的前提條件下，借助于酶細(xì)胞化學(xué)的手段，檢測(cè)某種物質(zhì)（抗原/抗體）在組織細(xì)胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)：即預(yù)先將抗體與酶連結(jié)，再使其與組織內(nèi)特異抗原反應(yīng)，經(jīng)細(xì)胞化學(xué)染色后，于光鏡或電子顯微鏡下觀察分析的形態(tài)學(xué)研究方法。,,

16、為克服熒光抗體法的不足、并能在超微結(jié)構(gòu)水平定位抗原物質(zhì)的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替熒光色素標(biāo)記抗體，進(jìn)行組織細(xì)胞內(nèi)抗原或半抗原的定位，開辟了酶標(biāo)抗體技術(shù)免疫酶細(xì)胞化學(xué)之路。結(jié)合筆者經(jīng)驗(yàn)，介紹ICC染色中的主要程序：組織標(biāo)本的固定、切片、染色原理及步驟、結(jié)果判定及一些進(jìn)展、特殊應(yīng)用等供讀者參考。,第一節(jié)　固定和切片,一、固定若想得到理想的ICC染色結(jié)果、正確地判斷抗原物質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)的位置，除需有良好酶和抗

17、體外，保持組織細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的不動(dòng)性（Immobility）和免疫活性也是至關(guān)重要的。換言之，如果抗原物質(zhì)在組織細(xì)胞間彌散、丟失或失去免疫活性，無論如何努力染色都是徒勞的，所以說固定是ICC染色中非常重要的一環(huán)。ICC與其它組織學(xué)技術(shù)不同，除要求保存良好的結(jié)構(gòu)外，還需保存組織抗原的免疫活性。一般認(rèn)為，新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性，但結(jié)構(gòu)較差，易出現(xiàn)抗原彌散丟失現(xiàn)象。,,Cumming（1980）報(bào)告，不固定的組織切片IC

18、C染色時(shí)，環(huán)鳥苷酸含量丟失80%以上。固定的目的是使構(gòu)成組織細(xì)胞成分的蛋白等物質(zhì)不溶于水和有機(jī)溶劑，并迅速使組織細(xì)胞中各種酶降解、失活，防止組織自溶和抗原彌散，保持組織細(xì)胞的完整性和所要檢測(cè)物質(zhì)的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關(guān)鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多，選擇時(shí)應(yīng)根據(jù)所要檢測(cè)物質(zhì)的抗原性質(zhì)和切片方法以及所用抗體特征等做最佳篩選。制片及固定方法見第一章　，下面介紹兩種近年報(bào)道的新方法。,1．AMEX（Acetone M

19、eth Enzoate Xylene ）法　　是改良的冰凍置換法（freeze substitution）的簡(jiǎn)稱，主要用于石蠟包埋標(biāo)本。Sato(1986)報(bào)告，該法具有同新鮮（未固定）組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結(jié)構(gòu)保存。其機(jī)制為：組織在丙酮中固定（脫水），組織細(xì)胞內(nèi)水份逐漸被丙酮取代，繼之，用苯甲酸酯取代組織內(nèi)丙酮，經(jīng)二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內(nèi)過夜亦形成冰晶，所以原方法將組織先置4℃丙酮20～

20、30min，再移入-20℃丙酮過夜。實(shí)際上組織在4℃丙酮內(nèi)過夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內(nèi)加入少量蛋白酶活性阻斷劑，并采用低溶點(diǎn)石蠟包埋等，可獲得更佳染色結(jié)果。,微波固定（Microwave fixation）,為近幾年所注目的問題之一。該方法能保持良好的組織結(jié)構(gòu)和抗原性，適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機(jī)理可能與微波（頻率1000～3000MHz）具有被水分吸收的性質(zhì)（通常所用的微波是頻率2450MHz，

21、波長(zhǎng)12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，促進(jìn)固定液向組織內(nèi)滲透，加速與組織成分的反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)達(dá)到固定的效果等有關(guān)。經(jīng)微波照射固定的組織，需置相同固定液中，繼續(xù)固定2～6h，室溫。,二、切片,光鏡ICC染色，常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種，二者各有其優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室條件，合理選擇之。對(duì)未知抗原顯示時(shí)，最好同時(shí)應(yīng)用。冰凍切片為ICC研究所首選。,,Shi（1991）等報(bào)告：微波爐照射的切片，能

22、夠激活部分核內(nèi)抗原活性。其機(jī)制不清，可能與高溫、高熱的作用，使核內(nèi)DNA雙鏈解開，DNA、RNA解離，抗原暴露有關(guān)。其步驟為：將切片脫蠟水洗后，置染色瓶中，加入去離子水或緩沖液至瓶頸處，反復(fù)多次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，補(bǔ)充瓶中蒸發(fā)掉的液體，照射溫度不超過90～95℃為宜。此處理后，細(xì)胞核染色以蘇木精為佳,第二節(jié)　染色方法,一、本科標(biāo)抗體法酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過共價(jià)鍵將酶連結(jié)在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異

23、催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位。,,（一）酶的種類及特點(diǎn)從理論上講，用細(xì)胞化學(xué)方法能顯示的酶，均可用于標(biāo)記抗體，進(jìn)行ICC染色，但實(shí)際上在ICC中所能用的酶并不多。現(xiàn)將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時(shí)參考。,,,Sternberger(1986)指出，用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點(diǎn)①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察；②所

24、形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位；③較易獲得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存1～2年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性（Turnover）越高越好；⑤酶標(biāo)過程中，酶與抗體連結(jié)，不能影響二者的活性；⑥被檢測(cè)組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。,（二）本科標(biāo)抗體的制備（Boosma,DM, 1983）,酶標(biāo)抗體與熒光色素標(biāo)記抗體不同，它需借助橋-偶聯(lián)

25、劑的作用，將酶連結(jié)在抗體分子上。偶聯(lián)劑是一種雙功能試劑，具備3個(gè)基本特征：①偶聯(lián)劑與抗體和酶之間的連結(jié)，必須是不可逆的，即借共價(jià)鍵連結(jié)；②偶聯(lián)劑不應(yīng)影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯(lián)劑的加入，使酶與組織成分了生非特異結(jié)合?？贵w制作步驟未列出,（四）染色原理及步驟,1．基本原理　　酶標(biāo)抗體與熒光色素標(biāo)記抗體的染色相同，亦分直接法和間接法。直接法是將酶直接標(biāo)記在每一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。間接法所

26、用的第一抗體是對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)某種抗原的特異性抗體（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而絕大數(shù)單克隆抗體系由小鼠制備）；第二抗體則為第一抗體（家兔/小鼠的IgG）的抗體。所以，只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同一標(biāo)記的第二抗體就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可避免了直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以間接法為常用，在此著重介紹間接法的染色程序。,2．染色程序,（1）切片準(zhǔn)備：見第一章　

27、。　?、偈炃衅?jīng)二甲苯或Hemo-De脫蠟，下行酒精至水。②固定/無固定新鮮組織冰凍切片，室溫干燥2h以上。　?。?）未固定的新鮮組織切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，簡(jiǎn)而言之，即用蛋白酶處理，去除固定劑交聯(lián)造成的空間遮蔽（室溫），風(fēng)干15～30min.;已固定的組織冰凍切片及石蠟切片，根據(jù)需要可進(jìn)行組織抗原的激活。,,（3）用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以避免孵育液流失及孵育過程中切片干燥，同時(shí)也能節(jié)

28、　省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風(fēng)干。石蠟切片（滴少量PBS，以防其干燥）直接進(jìn)行步驟（6）。（4）切片經(jīng)PBS或其它緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰凍切片上的OCT包埋劑。但應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時(shí)，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。（5）根據(jù)需要，用甲醇+0.3%H2O2處理切片15～30min（室溫），封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性。應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時(shí)，此步可省略。,（6）PBS漂 洗2min（共兩次），

29、移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min（室溫）。Tween-20為一種表面活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示。（7）4%Block Ace或0.1%～1%BSA濕盒內(nèi)孵育15～25min（室溫），然后；輕輕棄去孵育液（不沖洗）；以阻斷組織與抗體的非特異性結(jié)合，降低背景染色。（8）根據(jù)需要，可用1/5～1/30正常來活兔/羊血清孵育15～20

30、min（室溫，以酶標(biāo)抗體相同種屬正常血清為宜，最好是同一動(dòng)物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀釋酶標(biāo)抗體時(shí)，加入1%～2%的同一種屬正常血清。,9）輕輕棄去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀釋的第一抗體（抗體用量：每張切片一般為50～80μl），濕盒內(nèi)孵育1～2h（20～25℃）；免疫電鏡用標(biāo)本，4℃過夜。（10）PBS充分沖洗（3次×2min），以去除切片上非特異吸附的抗體。應(yīng)用不同的第一抗體或

31、同時(shí)進(jìn)行對(duì)照標(biāo)本染色時(shí)，需分別沖洗，以防相互污染。（11）經(jīng)0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀釋的HRP酶標(biāo)記的第二抗體,濕盒內(nèi)孵育45～60min(20～25℃)。,,（12）PBS漂洗（3次×2min）,此處不需分別漂洗，因所有切片均系同一酶標(biāo)抗體孵育。（13）未固定或固定較弱的冰凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以

32、防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室溫）此時(shí)輕微固定，既不影響抗原抗體結(jié)合，又較有利于保存第一抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。,（14）呈色：HRP標(biāo)記抗體的呈色液為0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片經(jīng)PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液內(nèi)10

33、～15min（室溫、暗處），亦可鏡下控制顯色速度。終產(chǎn)物為棕褐色沉淀。用于電鏡觀察的標(biāo)本，呈色3～5min即可，防止DAB終產(chǎn)物向周圍擴(kuò)散，影響超微結(jié)構(gòu)定位。另外，顯色液應(yīng)于用前新鮮配制，避免DAB本身氧化變質(zhì)。新配制的DAB為無色透明液體。若DAB液已氧化變?yōu)樽霞t色，應(yīng)換新藥重新配制。（15）將切片置流水中（僅光鏡觀察）或PBS（電鏡標(biāo)本）內(nèi)，終止呈色反應(yīng)。（16）未固定的冰凍切片，可用1%戊二醛-PBS液加強(qiáng)固定5～10min（

34、室溫），流水沖洗。,17）細(xì)胞核輕度染色，以甲基綠和蘇木精為常用。前者細(xì)胞核呈綠色，與HRP/ALP等終產(chǎn)物對(duì)比度尤佳，但不適于微波照射的標(biāo)本。蘇木精是組織學(xué)、病理學(xué)研究中普遍應(yīng)用的核染色方法，與HRP、ALP的終產(chǎn)物對(duì)比度比較好。（18）DAB呈色的標(biāo)本，可以系列酒精脫水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物質(zhì)呈色的標(biāo)本，在有機(jī)溶劑中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固劑如明膠甘油等封固，次日，于蓋玻片周圍涂少許女士用指甲油，可使

35、切片保存時(shí)間更長(zhǎng)。（19）鏡檢、觀察記錄同一般形態(tài)學(xué)研究。（20）免疫電鏡用標(biāo)本，經(jīng)OSO4后固定，按電鏡標(biāo)本要求處理（參見本書第七章?。Ｒ嗫蒓SO4固定，噴碳（Carbon Coating）,利用掃描電鏡觀察抗原的存在部位。,免疫組化的試劑準(zhǔn)備,最重要的是選擇好一抗、二抗或者還有三抗，注意抗體的特異性、效價(jià)和交叉反應(yīng)，最好用單抗。其他常用試劑有：1、0.01M(pH7.4)的磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），稀釋抗體和洗片子用；

36、2、清潔液、純水，洗玻片用3、多聚賴氨酸處理載玻片，防止脫片4、固定液：4%多聚甲醛或冷丙酮等；5、15%~30%蔗糖，組織脫水用；,6、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，或者OCT包埋做冰凍切片；7、抗原修復(fù)液：枸櫞酸緩沖液（pH6.0）；8、活化劑：EDTA或者Triton X-100；9、1%~10%牛血清清蛋白（BSA）封閉液；10、H2O2，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；11、顯色液：根據(jù)你做的酶來選擇，如果是HR