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文檔簡介
1、血栓與止血的篩選試驗及其臨床應(yīng)用,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院王鴻利 王學(xué)鋒,迄今,檢測血栓與止血的試驗逾百種,大致可分為篩選試驗、確診試驗、排除試驗和基因分析等四大類。本文僅就篩選實驗,如出血時間(BT)、血小板計數(shù)(PLT),活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT),纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDPs)、D-二聚體(D-D),血小板功能分析儀(PFA-100)、血栓彈力圖(TEG)的檢測其臨床應(yīng)用作一簡述。,圖1
2、 血管內(nèi)皮細(xì)胞與止血系統(tǒng),(一)一期出血缺陷篩檢試驗的應(yīng)用,1.一期止血缺陷 是指血管壁和血小板異常所引起的止血功能缺陷,主要是由于毛細(xì)血管壁通透性、脆性增加或血小板數(shù)量、質(zhì)量異常所致的出血。,2.臨床特點 出血以皮膚、黏膜為主,重者可伴有內(nèi)臟出血;但肌肉、關(guān)節(jié)等組織出血罕見。 對壓迫、縫合、外用止血劑或輸注血小板治療有效,但對血漿和血漿凝血因子制品無效。3.篩選試驗 出血時間(BT) 血小板計數(shù)(PLT)
3、,篩選試驗1.出血時間(BT,模板式刀片法/出血時間測定器法)反映毛細(xì)血管壁與血小板相互作用:毛細(xì)血管的完整性、收縮性以及血小板數(shù)量、功能的實驗。參考范圍:TBT法:6.9±2.1 min,臨床意義:BT延長(>9.0min)(1)PLT↓與BT↑呈負(fù)相關(guān),PLT愈↓BT愈↑。(2)血小板功能異常:血小板無力癥、巨血小板綜合征、灰色血小板綜合征等。(3)部分凝血因子缺乏:低/無纖維蛋白原血癥、血管性血友?。╲WD)等
4、。(4)遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥。(5)藥物:阿司匹林(ASA)、氯吡格雷(玻立維)和阿昔單抗等。,方法學(xué)評價 上海瑞金醫(yī)院對126例ITP和20例vWD患者檢測BT結(jié)果列于表1;對BT的三種方法比較見表2。 表1 ITP和vWD應(yīng)用兩種BT法檢測的結(jié)果,* P<0.01,表2 三種BT檢測方法的比較,2.血小板計數(shù)(PLT) 單位容積的循環(huán)血液中所含血小板的數(shù)量 (×109/L )
5、。方法:(1)直接血小板計數(shù)法(普通顯微鏡法/相差顯微鏡法);(2)血液分析儀(電阻抗法/光散射法);(3)流式細(xì)胞儀法。參考范圍:國內(nèi):85~320 ×109/L (成人);通常是100 ~300 ×109/L 。,臨床意義(1)血小板減少(<100 ×109/L ):PLT>50 ×109/L ,出血少見;50~30 ×109/L,外傷性出血;<20×109/L
6、 ,自發(fā)性出血,常需輸注血小板制品。 血小板減少原因:生成減少、破壞增多、消耗過多、分布異常等。(2)血小板增多( > 400 ×109/L ):PLT400 ~600 ×109/L,需觀察;PLT > 600 ×109/L,需治療; PLT> 600 ×109/L ,需血小板分離。血小板增多原因:骨髓增生性疾病、反應(yīng)性血小板增多。,方法學(xué)評價 ICSH推薦:一般用血涂片法觀察血小板分
7、布并與計數(shù)核實。(1)草酸胺稀釋-相差顯微鏡計數(shù)血小板;(2)流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)。 經(jīng)國際11個實驗室用CD41、CD61驗證,該法準(zhǔn)確度、精密度很好,可作為自動血細(xì)胞分析儀的校準(zhǔn)和PLT減少的準(zhǔn)確性的驗證。,圖 2 一期止血缺陷的篩選試驗,圖3 先天性初期止血異常的實驗室檢查,獲得性初期止血異常的實驗室檢查,(二)二期止血缺陷篩檢試驗的應(yīng)用,1.二期止血缺陷 是指凝血障礙和抗凝物質(zhì)所引起的止血功能缺陷,主要是由于凝血因子缺乏
8、或體內(nèi)產(chǎn)生病理性抗凝物質(zhì)所致出血。,2.臨床特點 出血以肌肉、關(guān)節(jié)為特點、也可有內(nèi)臟、皮膚出血 對血漿、血漿凝血因子制品有效,但對壓迫、外用止血劑和輸血小板療效欠佳。3.篩選試驗 活化部分凝血活酶時間(APTT) 血漿凝血酶原時間(PT),圖 4 凝血系統(tǒng)及其篩選實驗,1.活化的部分凝血活酶時間(APTT) APTT是內(nèi)源凝血途徑的常用和較敏感的篩選試驗。參考范圍:傳統(tǒng)的是31~43s;目前隨著儀器和試
9、劑的開發(fā),其參考值不一,尚難統(tǒng)一。正常對照值:傳統(tǒng)的須測對照值,以測定值較對照值延長>10s為異常;目前也未統(tǒng)一。APTTR:患者APTT/正常對照APTT比值,尚未得出參考范圍,尚未推廣應(yīng)用。,臨床意義(1)內(nèi)源性凝血途徑因子缺陷:FⅧ(血友病A)、FⅨ(血友病B)、FⅪ、FⅫ、PK和HMWK等遺傳性缺乏癥。(2)內(nèi)源性凝血途徑因子抑制物存在:常見FⅧ、 FⅨ抑制物,狼瘡抗凝物(LA),應(yīng)選用鞣花酸為激活劑更敏感。(3)藥
10、物所致異常:常見肝素(患者APTT/正常人APTT比值為1.5~2.5為治療范圍)、輸注庫血引起凝血病等。(4)纖溶活性增強:尤其是多見于繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)(DIC),而原發(fā)性纖溶很少延長。,方法學(xué)評價(1)激活劑:白陶土、硅藻土和鞣花酸的敏感性比較,見表3 表 3 不同激活劑對APTT敏感度比較,(2)凝血時間檢測的敏感性比較:瑞金醫(yī)院對血友病患者凝血時間的敏感度作比較,延長率(%):APTT 95%,硅管法CT100%
11、,ACT100%,而試管法CT為70%,故目前用APTT為篩選實驗簡單、方便、實用。,2、血漿凝血酶原時間(PT) PT是外源凝血系統(tǒng)常用和較為敏感的篩選實驗。參考范圍:傳統(tǒng)法為12 ± 1s(11~13s);目前,隨著儀器和試劑不同,參考范圍也有不同。尚未統(tǒng)一。正常對照組:傳統(tǒng)法為測定值較正常對照組>3s為異常,目前也未統(tǒng)一。PTR 參考范圍:1.00 ±0.05,已在應(yīng)用。,臨床意義(1)PT延長
12、:見于遺傳性/獲得性外源凝血系統(tǒng)的凝血因子缺乏;獲得性常見于DIC、依K因子缺乏、口服抗凝劑、肝?。谎h(huán)血抗凝物質(zhì):肝素、FDP、抗因子抗體。(2)PT-INR 多用于監(jiān)測口服抗凝劑(華法林)。INR<1.5提示抗凝劑無效;INR 1.5~2. 0 用于預(yù)防;INR 2.0 ~2. 5 常規(guī)抗凝; INR2.5 ~3.0 重度抗凝;INR >3.0 易致出血。,方法學(xué)評價(1)Hct<30%或>50%,抗凝劑和血液的比例應(yīng)按下式調(diào)整
13、(表4)抗凝劑量(mL)=(100-Hct)×血液量( mL) ×0.00185 表 4 Hct對PT和APTT測定結(jié)果的影響,,(2)凝血活酶(組織因子):兔腦、人腦、重組組織因子(rTF)對PT的結(jié)果,不盡相同。 rTF >人腦>兔腦(3)緩沖劑 其維持血漿pH,防止易變因子失活;如果無緩沖劑,血漿pH增加,PT延長。,(三)、篩選試驗的聯(lián)合應(yīng)用,主要是PT、APTT和PLT的聯(lián)合應(yīng)用。,1)PT(
14、N)、APTT和PLT(N),2)PT(↑)、APTT(N)和PLT(N),3)PT(↑)、APTT(↑)和PLT(N),4)PT(↑)、APTT(↑)和PLT(↓),5)PT(N)、APTT(N)和PLT(↑),6)有出血癥狀,但PT(N),APTT(N)和PLT(N),圖 3 先天性凝血異常的實驗室檢查,表 獲得性凝血性障礙項目的選擇和應(yīng)用,(四)纖溶活性增強篩選試驗的應(yīng)用,1、原發(fā)性纖溶性增強 指組織型纖溶酶原激活物(t-PA
15、)或尿激酶型纖溶酶原活物(u-PA)的活性增強所致纖溶性亢進(jìn)2、繼發(fā)性纖溶活性增強 幾乎都見于DIC,是指因子Ⅻa激活激肽釋放酶原(PK)生成激肽釋放酶(KK),KK激活纖溶系統(tǒng)所致纖溶活性增強。,3、篩選試驗纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)測定D-二聚體測定(D-D),圖5 FDP和D-D的生成,1、纖維蛋白原(Fg)和纖維蛋白(Fb)降解產(chǎn)物(FDPs)測定 指纖溶酶同時降解Fg和Fb產(chǎn)生的FDPs。(1)定性試
16、驗:膠乳凝集法。陰性:血清FDP含量<10μg/mL,血漿FDP含量<5μg/mL,尿液FDP含量<2μg/mL。陽性:血清FDP含量≥10μg/mL,血漿FDP含量≥ 5μg/mL,尿液FDP含量≥ 2μg/mL。,(2)定量試驗:ELISA法。包被于固相的FDP抗體與樣本中FDP(抗原)結(jié)合,加入酶標(biāo)抗體后形成夾心復(fù)合物,呈顯色反應(yīng)。 參考值:<5 μg/mL。,2、D-二聚體(D-D)測定 指纖溶酶特異性降解纖維蛋白
17、(Fb)所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。(1)定性試驗:膠乳凝集試驗。陰性:無凝集顆粒者,即D-D含量<0.5μg/mL陽性:有凝集顆粒者,即D-D含量≥0.5μg/mL半定量:以<0.5μg/mL、 ≥0.5μg/mL×陽性時的最大稀釋倍數(shù)。,(2)定量試驗:ELISA法。 參考范圍: <0.5μg/mL(3)定量試驗:膠體金法。將血漿加入檢測卡孔內(nèi),血漿中D-D吸附于包被有D-D單抗膜中,再加入D-D單抗-膠體金耦聯(lián)物
18、溶液,膜中D-D將與金標(biāo)抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng),用光筆閱讀儀讀數(shù)。 參考范圍: <0.3 mg/L,臨床應(yīng)用(1)纖溶活性增強篩檢試驗的應(yīng)用 FDP正常,D-D正常:多數(shù)為正常人,提示無纖溶過度現(xiàn)象。 FDP陽性,D-D正常:多數(shù)為FDP的假陽性或原發(fā)性纖溶癥。 FDP正常,D-D陽性:多數(shù)為FDP假陰性或繼發(fā)性纖溶癥。 FDP陽性,D-D陽性:多數(shù)為繼發(fā)性纖溶癥,常見于DIC。,(2)在診斷DIC中的應(yīng)用 見
19、表 5 表5 FDP和D-D在診斷DIC中的應(yīng)用,(3)D-D在排除靜脈血栓(VTE)中的應(yīng)用 D-D測定在排除VTE中有重要價值(表6)。 表 6 D-D測定在排除VTE中的應(yīng)用,方法學(xué)評價(1)對VTE的診斷:D-D測定有高度敏感性和陰性預(yù)測值,但特異性較低。因此,D-D測定陰性可排除VTE,陽性不一定是VTE。(2)D-D測定,WHO規(guī)定用ELISA法,臨界值為500 μg/L。因此D-D測定值<500 μ
20、g/L排除VTE,幾乎為100%,> 500 μg/L診斷VTE的可能性為40%,必須結(jié)合其他影象檢查。,(3)D-D測定陰性時,結(jié)合臨床低/中危險度,其排除價值更大;D-D測定陽性時,結(jié)合臨床高危險度和影象檢查診斷價值更大。(4)FDP和D-D陽性可見于老年人、妊娠、癌腫、DIC、肝病、感染、炎癥、創(chuàng)傷、手術(shù)、溶栓治療、冠心病等。判斷結(jié)果時要充分考慮。,(五)DIC篩選試驗的應(yīng)用,診斷DIC必須符合下列4項:(1)引起DIC的基
21、礎(chǔ)疾病:病因診斷(2)有DIC的臨床表現(xiàn):臨床診斷(3)DIC的實驗室檢查:實驗診斷(4)對肝素治療有效:治療診斷,臨床應(yīng)用1、國外DIC的記分診斷標(biāo)準(zhǔn)(表9),2、國外DIC的記分診斷標(biāo)準(zhǔn)(表10),3、日本厚生省DIC診斷記分標(biāo)準(zhǔn) 表11,注:計分>7分確診DIC,計分6可疑DIC,<5則可能性少,可疑時補做:Sfmc、DD、TAT、PAP,動態(tài)plt,抗凝治療有效,4、國內(nèi)基層單位DIC診斷標(biāo)準(zhǔn)(1999)對臨床懷疑,
22、有下列7項中3項即可診斷DIC(1)PLT<50×109/L或進(jìn)行性↓(2)Fg <1.5g/L或≥4.0g/L,且呈進(jìn)行性變 化(3)3P試驗(+)或FDP ≥20mg/L(4)PT縮短/延長>3s,或呈動態(tài)變化(5)外周血涂片破碎紅細(xì)胞>10%(6)ESR <15mm/h(7)血凝塊在2h內(nèi)出現(xiàn)溶解現(xiàn)象,方法學(xué)評價1、DIC常用實驗指標(biāo)的評價(表7),2、DIC聯(lián)合實驗指標(biāo)分析(表8),方法學(xué)評價
23、 見表7、表8。我院對864例DIC患者進(jìn)行統(tǒng)計,它們的敏感性、特異性和診斷準(zhǔn)確率分別為60%、66%和63%;對DIC前期109例患者的敏感性、特異性和診斷準(zhǔn)確率分別為80%、68%和74%。Wada等(2003)DIC的診斷標(biāo)準(zhǔn)作了前瞻性評價,結(jié)果顯示:敏感性為91%,特異性為97%。由此可見,所用DIC實驗診斷指標(biāo),基本上可以滿足臨床需求。,(六)自動化儀器在血栓 與止血篩選試驗中的應(yīng)用,1、血
24、栓彈力圖(thrombelastograph,TEG) 承載全血標(biāo)本的測試杯以4º45’左右擺動,當(dāng)杯中凝血啟動,置于杯中的金屬針受到凝血塊生成/溶解的切應(yīng)力作用,隨之一起擺動。金屬針在擺動過程中所產(chǎn)生的電流,經(jīng)電腦軟件處理后,便形成曲線。這種儀器稱血栓彈力儀,所形成的曲線稱血栓彈力圖(TEG),圖6 TEG各參數(shù)的形成,表 12 TEG主要參數(shù)及其含量,臨床應(yīng)用,(1)判斷凝血狀態(tài):低凝、高凝狀態(tài) 低凝狀態(tài):R、K值
25、都延長 高凝狀態(tài):R、K值都縮短 指導(dǎo)血漿制品的選擇(2)判斷肝素/LMWH療效:有效、過量、抵抗 普通檢測R、K值=肝素R、K值,示無肝素存在 普通檢測R、K值>肝素R、K值,示有肝素存在 指導(dǎo)肝素/LMWH使用和魚精蛋白中和,(3)判斷抗血小板治療:有效、過量、抵抗 用TEG的血小板定位圖(platelet mapping)。 使用抗血小板藥后血小板抑制率<20%為抵抗。 使用抗血小板藥后血小板抑制
26、率50%~75%為有效。(4)評估非心臟手術(shù)后血栓事件的發(fā)生率 應(yīng)該維持MA值<67mm將大大降低血栓事件 若MA值> 67 ~72mm,血栓發(fā)生率為16%。 若MA值> 72 ~95mm,血栓發(fā)生率為32%。,(5)評估PCI后血栓事件的發(fā)生機率 若PCI后,MA值>65~68mm,發(fā)生率為10%。 若PCI后,MA值>68~72mm,發(fā)生率為14%。 若PCI后,MA值>72mm,發(fā)生率為60%。(6)其
27、他應(yīng)用 區(qū)別原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶(DIC) 判斷高凝狀態(tài)原因:凝血亢進(jìn)、血小板活性↑ 鑒別手術(shù)出血:外科出血、內(nèi)科出血,2.血小板功能分析儀(platelet function analyzer-100,PFA-100) 體外篩選血小板黏附和聚集的儀器。以標(biāo)有膠原/腺上腺素(CEPI)和膠原/ADP(CADP)兩種纖維膜為誘導(dǎo)劑,以觀察膜孔閉合時間(closure time,CT)為結(jié)果。參考范圍 CEPI為61~20
28、3s;CADP:48 ~187s,,,,,,,,,,,In Vivo Haemostasis,PFA100.avi,,,capillary 200µm,aperture150µm,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,epinephrine or ADP,platelet,vWF,erythrocyte,,,,,,FLOW,,,- 40 mbar,,,collagen,membrane,,,,,,,,
29、PFA-100® Test Principle,lumen,fibrinogen,platelet,collagen fibrils,erythrocyte,endothelial cell,vWF,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,臨床應(yīng)用 一期止血缺陷的篩選試驗。敏感性:CEPI/CADP為82.5%/66.9%特異性:
30、 CEPI/CADP為88.7%/85.5%陰性預(yù)測值: CEPI/CADP為83%/75%陽性預(yù)測值: CEPI/CADP為88%/79%,vWD:CEPI/CADP的敏感性為88%/87%;特異性為95%/95%。血小板無力癥:CT延長,可替代BT,準(zhǔn)確、可靠。服用ASA時:CEPI的CT延長,CADP可正常;與其他疾病與藥物誘導(dǎo)血小板功能異常鑒別的敏感性和特異性分別為100%和50%。,方法學(xué)評價 PF
31、A-100操作簡便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確。CEPI/CADP的變異系數(shù)為12%/8%,與PAgT有良好相關(guān)性。 受PLT↓、貧血(Hct<30%)、O型血型、3.8%枸櫞酸鹽和富含核黃素食物等的影響;Fg的裂解肽可影響 Fg-vWF/GPⅡb-Ⅲa的結(jié)合,圖 實驗室檢測的全面質(zhì)量管理注:分析測定包括:工作環(huán)境、人員素質(zhì)、室間質(zhì)評、室內(nèi)質(zhì)控、儀器設(shè)備、操作標(biāo)準(zhǔn)、試劑準(zhǔn)備、方法選擇。,,,分析中質(zhì)量保證,謝謝,請指導(dǎo)。
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