結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化與新診斷技術(shù)進(jìn)展

1、結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化與新診斷技術(shù)進(jìn)展,,強(qiáng)化結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)化的必要性,1、全球結(jié)核病控制的三大挑戰(zhàn)：耐藥結(jié)核病、HIV/艾滋病合并結(jié)核病、移民（流動(dòng)人口）2、我國(guó)結(jié)核病疫情依然嚴(yán)重3、目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的不足,分類,結(jié)核分枝桿菌屬原核生物界、厚壁菌門、裂植菌綱、放線菌目、分枝桿菌科的分枝桿菌屬，分枝桿菌屬種類甚多，目前已命名的有200多種，一般可分為緩慢生長(zhǎng)和快速生長(zhǎng)兩大類。,結(jié)核分枝桿菌特點(diǎn),結(jié)核菌生長(zhǎng)緩慢，在一般

2、培養(yǎng)基上分裂一代需要10-20小時(shí)細(xì)胞壁厚度為10~35nm，較一般細(xì)菌的細(xì)胞壁厚，含有大量脂類，具有堅(jiān)韌性和疏水性?？顾嵝允欠种U菌的重要特征。,結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查的重要作用,細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病最客觀、最科學(xué)和最重要診斷方法和流行病學(xué)研究工具。因此結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)仍然面臨著較多的問(wèn)題。,細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)存在的問(wèn)題,不易于標(biāo)準(zhǔn)化操作誤差較大（可達(dá)到30%） 1、個(gè)人操作誤差 2、標(biāo)本性狀 3、標(biāo)本來(lái)源對(duì)結(jié)果的理

3、解差異可影響檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床治療的參考或指導(dǎo)意義。,主要的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),1、痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)2、分枝桿菌分離培養(yǎng)技術(shù)3、分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)4、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)技術(shù)5、分枝桿菌菌種鑒定技術(shù),標(biāo)準(zhǔn)的痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù),標(biāo)本的收集，特別是痰標(biāo)本的采集、保存制片和染色過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化讀片操作的熟練程度和標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)結(jié)果的理解,痰標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)送,膿樣、干酪樣或膿性粘液樣痰為合格標(biāo)本，痰量應(yīng)為3-5毫升。難以獲得合格標(biāo)

4、本時(shí)，也應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，但應(yīng)注明標(biāo)本性狀，以供分析結(jié)果時(shí)參考。容器上應(yīng)注明與檢驗(yàn)單一致的病人姓名、編號(hào)及日期。不能及時(shí)檢驗(yàn)的痰標(biāo)本應(yīng)置4C冰箱保存，如需轉(zhuǎn)運(yùn)，外送前要認(rèn)真核對(duì)檢驗(yàn)單與痰瓶上標(biāo)注，放在專用的轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)運(yùn)送。,標(biāo)本的采集,標(biāo)本留取方法痰標(biāo)本的留取應(yīng)在醫(yī)護(hù)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行。醫(yī)護(hù)人員應(yīng)告知病人如何咳痰，合格的痰標(biāo)本是深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物，并說(shuō)明唾液檢出的可能性很小。檢驗(yàn)人員檢查痰標(biāo)本的性狀，并在登記本和檢驗(yàn)

5、報(bào)告單上注明（按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分類登記）。,如何正確留痰,查痰對(duì)于結(jié)核病的診斷是非常重要的，通過(guò)痰檢可以知道您是否痰中帶菌。如果痰中帶有結(jié)核菌說(shuō)明您患有肺結(jié)核，具有傳染性，應(yīng)該及時(shí)遵醫(yī)囑治療。 送檢痰標(biāo)本的質(zhì)量直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。請(qǐng)您一定按照下列要求和方法留取合格的痰標(biāo)本。每個(gè)痰盒應(yīng)分別留取1～2口痰，請(qǐng)不要將1口痰分開放到2或3個(gè)痰盒中。正確的咳痰方法： 1、咳嗽前應(yīng)緩慢地深吸氣，吸氣后稍

6、屏氣片刻。 2、軀干略向前傾，兩側(cè)手臂屈曲，平放在兩側(cè)胸壁下部，內(nèi)收并稍加力。 3、咳嗽時(shí)腹肌用力快速收縮，使腹壁內(nèi)陷。一次深吸氣，可連續(xù)咳嗽三聲。 4、停止咳嗽后，收縮腹肌將剩余的氣體盡量呼盡。 5、重復(fù)緩慢吸氣動(dòng)作或平靜呼吸片刻，準(zhǔn)備再次咳嗽的動(dòng)作。* 注意：部分人如果忽然深吸氣容易誘發(fā)咳嗽，您可以嘗試緩慢或分幾次吸氣，爭(zhēng)取肺泡內(nèi)充分充氣，以增加咳嗽的效率。在這一過(guò)程中，要注意動(dòng)作

7、的連貫性，一氣呵成。同時(shí)，也可以叩擊前胸，或由家屬協(xié)助叩擊后背胸壁。這樣震動(dòng)支氣管內(nèi)的分泌物，能夠增加咳嗽排痰的力度。,直接痰涂片檢查法,萋?tīng)?尼爾遜氏（Ziehl－Neelsen）抗酸染色法 （熱染法）,細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 —直接涂片法,操作流程,涂痰膜自然干燥,復(fù)紅加熱初染5分鐘,自然干燥鏡檢,流水沖洗,美蘭復(fù)染30

8、秒,鹽酸酒精脫色,流水沖洗,流水沖洗,,,,,,,,載玻片,（一）新載玻片必須經(jīng)95%乙醇脫脂，檢查無(wú)劃痕后 方可使用。（二）一張載玻片只能涂抹1份痰標(biāo)本。（三）載玻片只允許一次性使用，嚴(yán)禁清洗后重復(fù)用于AFB檢查。（四）載玻片正面一側(cè)1/3處標(biāo)注實(shí)驗(yàn)室序號(hào)(如使用的載玻片一端無(wú)磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號(hào)；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。（五）載玻片正面另一側(cè)2

9、/3中央處均勻涂抹成面積為10×20 mm的卵圓形痰膜。,染色,（一）嚴(yán)格按照操作規(guī)范完成染色程序。（二）染色后的痰膜應(yīng)呈均勻亮藍(lán)色，無(wú)紅色斑塊。（三）將染色后的玻片放置在報(bào)紙上，如果透過(guò)痰膜不能分辨報(bào)紙上的文字，則表明該玻片涂抹過(guò)厚，或染色過(guò)程有誤。（四）染色后的痰膜脫落部分應(yīng)小于整個(gè)涂抹面積的10%。,（一）為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴(yán)禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。（二）仔細(xì)觀察300以上的視野。（三）每個(gè)工作日

10、，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應(yīng)超過(guò)25張。（四）連續(xù)閱讀10～12張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。,鏡檢讀片,,痰涂片抗酸菌濃度與陽(yáng)性結(jié)果機(jī)率 檢出菌數(shù) 每毫升標(biāo)本估算菌數(shù) 陽(yáng)性結(jié)果機(jī)率0/100或更多視野 ＜1000 ＜10％1-2/300視野 5000 - 10000

11、 50％1-9/100視野 約30000 80％1-9/10視野 約50000 90％（cv）1-9/每視野 約100000 96.2％（cv）10或更多/每視野

12、 約500000 99.95％（cv）,,,,查痰次數(shù)與陽(yáng)性機(jī)率關(guān)系為什么診斷前強(qiáng)調(diào)三涂?jī)膳啵?S 2C） 1 2 3 4 5,,,,,,,,,,,,,,,,,,細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 —直接涂片法,顯微鏡檢報(bào)告方式：0條/300視野

13、： 萋-尼氏抗酸桿菌陰性1-8條/300視野：實(shí)報(bào)菌數(shù)3-9條/100視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（+）1-9條/10視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（2+）1-9條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（3+）?10條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（4+）,細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 —直接涂片法,注意事項(xiàng)：選擇痰標(biāo)本中膿性、血樣、干酪樣的部分涂片陽(yáng)性率較高；一張玻片只涂

14、一份標(biāo)本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打開痰盒、涂抹痰膜時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)注意正確操作和自身防護(hù)；石炭酸復(fù)紅初染時(shí)必須加溫。,細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 —直接涂片法,優(yōu)點(diǎn)：是直接發(fā)現(xiàn)原菌的檢查方法，適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標(biāo)本，有重要的臨床診斷價(jià)值。是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的重要途徑，是考核和評(píng)價(jià)療效的重要指標(biāo)，有重要的流行病學(xué)意義；操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，適于各

15、級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展；快速，數(shù)小時(shí)可報(bào)告結(jié)果。,細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 —直接涂片法,缺點(diǎn)：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽(yáng)性結(jié)果；特異性較低：只能報(bào)告“抗酸菌陽(yáng)性”，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能辨別死、活菌。,涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng) —室內(nèi)質(zhì)控,標(biāo)本收集、染色液制備、涂片染色程序、顯微鏡鏡檢、顯微鏡的保養(yǎng)和維護(hù)、結(jié)果的報(bào)

16、告和登記、痰片的分類保存等應(yīng)按照國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行操作。復(fù)查方式：自查：試驗(yàn)員當(dāng)日對(duì)已查涂片抽樣復(fù)查?；ゲ椋河杀緦?shí)驗(yàn)室其他試驗(yàn)員抽查當(dāng)日10%涂片。,涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)—室間質(zhì)控,以現(xiàn)場(chǎng)和非現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)為主要方式?，F(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)：質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室人員赴被質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室就實(shí)驗(yàn)室布局、安全防護(hù)、污染物處理、涂片染色操作、顯微鏡維護(hù)狀況、日常實(shí)驗(yàn)記錄等進(jìn)行考核和指導(dǎo)，并以盲法、按比例抽取涂片復(fù)查。非現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)：防治人員依據(jù)盲法、按比例的原

17、則抽取涂片交實(shí)驗(yàn)室復(fù)查。,復(fù)檢玻片樣本量,1.樣本量估算：盲法復(fù)檢的關(guān)鍵是復(fù)檢結(jié)果能否真正代表被督導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際水平。世界衛(wèi)生組織推薦80%靈敏度、100%特異性（針對(duì)陰性玻片）、誤差為0的可接受數(shù)量以及95%可信限樣本量表，可以極大地減少樣本量，保證了盲法復(fù)檢在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上可以代表被評(píng)估實(shí)驗(yàn)室的總體水平。,復(fù)檢樣本量計(jì)算表,復(fù)檢樣本量計(jì)算表說(shuō)明：,a、玻片陽(yáng)性率：指所有檢測(cè)的玻片中陽(yáng)性玻片的比例（平均陽(yáng)性率）。b、上一年陰性玻片總數(shù)

18、：每年玻片的總數(shù)減去全年陽(yáng)性玻片數(shù)。c、抽樣時(shí)，當(dāng)上一年陰性玻片數(shù)量和玻片陽(yáng)性率不在選擇點(diǎn)，陰性玻片數(shù)值采用區(qū)間上限，玻片陽(yáng)性率采用區(qū)間下限。,復(fù)檢結(jié)果評(píng)價(jià),盲法復(fù)檢的目的不是為了驗(yàn)證某個(gè)病人診斷正確與否,而是評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室操作水平。評(píng)價(jià)的內(nèi)容除了玻片鏡檢結(jié)果存在的誤差之外，還包括檢查標(biāo)本的質(zhì)量（合格標(biāo)本與不合格標(biāo)本的比例）、涂抹的大小和厚度、染色質(zhì)量如何等,以便采取糾正措施，提高實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量。,1.誤差分類：分為定性誤差和定量誤

19、差（1）定性誤差包括高假陽(yáng)性和高假陰性高假陽(yáng)性（High False Positive HFP）：陰性片被錯(cuò)誤地判讀為2＋以上的陽(yáng)性。高假陰性（High False Negative HFN）：2＋以上的陽(yáng)性玻片被錯(cuò)誤地判讀為陰性。,（2）定量誤差包括量化誤差、低假陽(yáng)性和低假陰性量化誤差（Quantification Error ，QE）：同一張陽(yáng)性玻片初檢者和復(fù)檢者陽(yáng)性判斷級(jí)別的差異。低假陽(yáng)性（Low False Posit

20、ive ，LFP）：陰性玻片被錯(cuò)誤地判斷為1＋及以下的陽(yáng)性。低假陰性（Low False Negative， LFN）：1＋及以下玻片被錯(cuò)誤地判斷為陰性。,常見(jiàn)“誤差”原因,實(shí)驗(yàn)室診斷的新進(jìn)展,1、擴(kuò)大開展液體培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)2、引入現(xiàn)代分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)3、引入現(xiàn)代免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù),1、現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)主要技術(shù),實(shí)時(shí)熒光定量PCR環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè) ( Loop mediated isothermal ampli

21、fication， LAMP)分子線性探針（Hain 技術(shù)） (2008WHO推薦)基因芯片技術(shù)GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術(shù),（1.1）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,PCR誕生于1985年，由美國(guó) Muliis等發(fā)明。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸（DNA）復(fù)制原理而設(shè)計(jì)的體外DNA或核糖核酸（RNA）擴(kuò)增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，經(jīng)過(guò)n個(gè)周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子，使DNA

22、特定區(qū)段大量擴(kuò)增。此檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速，但也存在假陰性、假陽(yáng)性、污染等方面的問(wèn)題，研究人員對(duì)其進(jìn)行了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反應(yīng)體系加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴(kuò)增的同時(shí)可獲得定量的結(jié)果.即在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)完成擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

23、,從而省去了靶ＤＮＡ擴(kuò)增后復(fù)雜的定量檢測(cè)工作。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR,該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其擴(kuò)增產(chǎn)物的自動(dòng)和實(shí)時(shí)檢測(cè),減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測(cè)步驟,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和可比較性。同時(shí)工作效率大大提高。研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與Southern雜交和酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。,（1.2）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè) ( Loop mediated iso

24、thermal amplification， LAMP),檢測(cè)是連續(xù)等溫進(jìn)行的。擴(kuò)增效率十分高，反應(yīng)靈敏。采用4條引物，識(shí)別6個(gè)位點(diǎn)，特異性強(qiáng)。不需要特殊的試劑與儀器，總費(fèi)用很低。反應(yīng)不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測(cè)。利用Bst酶的鏈置換功能進(jìn)行反應(yīng)。加入反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測(cè)。,Purification for Ultra Rapid Extraction (PURE),LAMP 方法,PURE 方法,等溫

25、反應(yīng)高擴(kuò)增效率高特異性實(shí)驗(yàn)周期短(幾乎一個(gè)小時(shí)),簡(jiǎn)單去除核酸擴(kuò)增抑制因子縮短處理時(shí)間,Pre-treatment kit,LAMP test,Sample,Lysis,Mixture,,Filter,,DNA,LAMP 檢測(cè),,陰性,陽(yáng)性,不需要離心, 等溫, 快速 (整個(gè)過(guò)程只需一個(gè)小時(shí))；DNA與SYBR Green結(jié)合現(xiàn)示綠色 ，Bst聚合酶于30分鐘到一個(gè)小時(shí)內(nèi)可將 毫微微克/毫升 (fg/ml)（或500-100

26、拷貝/毫升）的DNA 或RNA擴(kuò)增到10微克左右。,LAMP 敏感度,,10,100,1000,NC,copies/reaction,模板: 純化的 TB 基因組DNA反應(yīng)條件: 67℃, 40min,LAMP結(jié)果分析,儀器特點(diǎn)：1.LAMP檢測(cè)專用，每隔6秒測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的濁度．2.可以設(shè)定相應(yīng)的反應(yīng)條件與檢測(cè)要求．3.測(cè)定結(jié)果可直接輸入電腦進(jìn)行實(shí)時(shí)分析． 4.檢測(cè)結(jié)果（圖像等）可以打印．5.可同時(shí)檢測(cè)32個(gè)樣本，８聯(lián)管適

27、用．,（1.3）、分子線性探針（Hain 技術(shù)）,原理：基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè)方法。擴(kuò)增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過(guò)顯色反應(yīng)判斷結(jié)果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復(fù)合群、快速檢測(cè)RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性,GenoType® 分支桿菌試劑盒系列,GenoType ® MTBC （來(lái)自于培養(yǎng)標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種間的鑒定）GenoType ® Mycobact

28、eria Direct（來(lái)自于病人標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定）GenoType ® Mycobacterium CM（來(lái)自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType ® Mycobacterium AS（來(lái)自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType ® MTBDRplus （結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測(cè)）GenoType

29、74; MTBDRsl （結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性檢測(cè)）,技術(shù)設(shè)備,TwinCubator® 手工雜交儀,自動(dòng)操作-全自動(dòng)雜交儀,GT-Blot®48 或 GT-Blot® 20,GenoType? MTBDRplus結(jié)果,MTBC及其對(duì)利福平和/或異煙肼的耐藥性,適用于培養(yǎng)物和痰液。 檢測(cè)快速，對(duì)于直接采集的樣本或陽(yáng)性培養(yǎng)物在數(shù)小時(shí)后內(nèi)即可完成檢測(cè)； 檢測(cè)INH單耐藥型TB、M

30、DR和XDR； 符合WHO推薦的線性探針?lè)治鰳?biāo)準(zhǔn)。,GenoType? MTBDRplus/sl – 優(yōu)點(diǎn),驗(yàn)證數(shù)據(jù),結(jié)論,DNA-Strip技術(shù)系列涵蓋了分枝桿菌菌種鑒定、TB-復(fù)合群的區(qū)分和藥敏試驗(yàn)。所有檢測(cè)都采用通用試劑盒和相同的方案進(jìn)行擴(kuò)增和雜交。 所有檢測(cè)均可在4-5小時(shí)內(nèi)完成。本法適用于大樣本量的檢測(cè)（每天檢測(cè)數(shù)百份樣品）。,（1.4）、基因芯片技術(shù),科學(xué)的發(fā)展人類的進(jìn)步要求進(jìn)行大規(guī)模基因信息的解析 鑒于基因芯片的

31、多種用途和其遠(yuǎn)大的發(fā)展前景，不少生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)和生物技術(shù)公司都先后參與了這項(xiàng)技術(shù)的研究。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)目前僅國(guó)內(nèi)就有十多家單位從事該技術(shù)的研究與開發(fā)工作，全世界估計(jì)至少有二三十家。它已象半導(dǎo)體技術(shù)一樣成為一個(gè)重要的產(chǎn)業(yè)方向。當(dāng)前已正被廣泛地應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，包括生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷學(xué)和基因組學(xué)研究。,什么是基因芯片,基因芯片指對(duì)數(shù)以千記的DNA片段同時(shí)進(jìn)行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達(dá)譜的檢測(cè)等（Trends in B

32、iotechnology)。 該技術(shù)系指將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷虾笈c標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥碾s交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。,基因芯片技術(shù)的主要特點(diǎn),技術(shù)操作簡(jiǎn)單 自動(dòng)化程高 序列數(shù)量大 檢測(cè)效率高 應(yīng)用范圍廣 成本相對(duì)低,博奧 分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法),主要分為樣品制備、芯片反應(yīng)和結(jié)果判讀三部分。 首先，將檢測(cè)菌的DNA從培養(yǎng)、分離純化的菌株或者

33、直接從臨床樣品中提取出來(lái)； 然后，對(duì)樣品中的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記； 接著，將擴(kuò)增并熒光標(biāo)記的基因序列與芯片上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)； 最后芯片掃描成像，用配套軟件進(jìn)行判讀。,芯片掃描結(jié)果 1,,臨床驗(yàn)證,（1.5）GeneXpert MTB/RIF快速診斷技術(shù),Cepheid® MTB/RIF: 可直接檢測(cè)痰液，檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的同時(shí)，鑒定是否有利福平耐藥性， 2小時(shí)出結(jié)果。GeneX

34、pert檢測(cè)平臺(tái)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)原理。所有檢測(cè)均無(wú)需提取核酸，手工操作時(shí)間不超過(guò)2分鐘。,GeneXpert 最大程度簡(jiǎn)化TB檢測(cè)?。?！,將痰液加入處理瓶，放置15分鐘；將處理后的樣品加入樣品反應(yīng)盒；將該盒子放置在GeneXpert中，輕松按下“開始”鍵；得到結(jié)果（2小時(shí)）：檢測(cè)是否含有結(jié)核分支桿菌的同時(shí)，可對(duì)利福平耐藥性進(jìn)行判讀。,Xpert MTB/RIF檢測(cè)操作步驟,1、痰液加入處理瓶， 放置15分鐘

35、。2、取處理后的痰液 2mL加入Xpert反應(yīng) 試劑盒3、將反應(yīng)試劑盒放入 GeneXpert儀器， 點(diǎn)擊“開始”（手工操作至此結(jié)束?。?、自動(dòng)過(guò)濾洗滌樣品5、自動(dòng)超聲破碎，純化 樣品6、熒光定量PCR擴(kuò)增7、巢氏PCR擴(kuò)增8、自動(dòng)結(jié)果判讀 （MTB/RIF）,“Sample in. Answer out.”,全自動(dòng)操作 完全封閉系統(tǒng) 污染可能

36、性小 減少人為錯(cuò)誤 結(jié)果精確度高 檢測(cè)時(shí)間短,無(wú)需專業(yè)技術(shù)人員和特殊實(shí)驗(yàn)室,研究人數(shù) >1,700 Patients? 秘魯、南非、阿塞拜疆、印度,? 涂片陽(yáng)性樣品：? 靈敏性98.2%,特異性99.2%? 涂片陰性, 培養(yǎng)陽(yáng)性樣品：? 三次檢測(cè)靈敏性 90.2%? 一次檢測(cè)靈敏性72.5% ? 對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)：? 靈敏性97.6%,特異性98.1%,結(jié)論,GeneXpert檢測(cè)Mtb簡(jiǎn)單、易于操作，對(duì)操作

37、者技術(shù)要求不高：只需要把痰液、反應(yīng)液加入儀器即可得出診斷報(bào)告；GeneXpert檢測(cè)Mtb快速：整個(gè)過(guò)程大約2小時(shí)。GeneXpert檢測(cè)Mtb對(duì)操作人員安全：整個(gè)檢測(cè)過(guò)程全封閉、一次性完成。高靈敏性：BCG—176 cfu/ml；H57Rv—112 cfu/ml耐藥性診斷：可對(duì)利福平耐藥性進(jìn)行檢測(cè),現(xiàn)代免疫學(xué)診斷技術(shù),1、體液免疫診斷技術(shù)：是利用結(jié)核分枝桿菌或其提取物抗原檢測(cè)結(jié)核病患者血清抗體的方法。目前，通過(guò)檢測(cè)抗結(jié)核桿菌的

38、抗體(IgG)診斷結(jié)核病的商品化試劑盒已較多。采用的方法包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)和免疫金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析法和膠體金標(biāo)記的滲濾法等，采用的抗原也各不相同。,體液免疫學(xué)診斷技術(shù)的意義,在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較廣泛，是結(jié)核病的輔助診斷方法之一,尤其對(duì)肺外結(jié)核、菌陰肺結(jié)核的診斷具有應(yīng)用價(jià)值。不足之處：?jiǎn)为?dú)使用時(shí)，其檢測(cè)的特異性和靈敏度都有些缺點(diǎn)。目前國(guó)際上反對(duì)使用該項(xiàng)技術(shù)的呼聲在增加。原因主要是特異性問(wèn)題。,2、細(xì)胞免疫學(xué)診斷技術(shù),細(xì)胞免

39、疫診斷技術(shù)應(yīng)用較少，過(guò)去主要應(yīng)用PPD皮試技術(shù)，近年來(lái)英國(guó)和澳大利亞研制了ELISpot 、T-Spot技術(shù)和 QFT-Gold 。此項(xiàng)技術(shù)用于感染情況的檢測(cè)是一項(xiàng)特異性較強(qiáng)、靈敏度較高很有希望的新技術(shù)。,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISpot)技術(shù) 是檢測(cè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的一種實(shí)驗(yàn)方法，采用可定量的夾心ELISA方法，利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6 & CFP-10刺激和激活免疫活性細(xì)胞使其產(chǎn)生IFN-?，并檢測(cè)IFN-?的濃

40、度變化進(jìn)行診斷的方法。通過(guò)ELISpot酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)加底物后形成的斑點(diǎn)分析后得出結(jié)果。ELISpot具有較高的特異性和敏感性。,ELISPOT技術(shù)原理,細(xì)胞免疫主要由T淋巴細(xì)胞發(fā)動(dòng)，T淋巴細(xì)胞分成效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和記憶T淋巴細(xì)胞。記憶T淋巴細(xì)胞在首次感染病原體后長(zhǎng)期存在免疫系統(tǒng)中。當(dāng)再次受到感染刺激后。這些記憶T淋巴細(xì)胞發(fā)出信號(hào)分子并增殖成為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如 干擾素(INF-γ )。所以無(wú)論是否有臨床癥

41、狀，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在血中的水平可作為機(jī)體是否被感染的指標(biāo)。,ELISPOT在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用,在MTB潛伏感染診斷中的應(yīng)用早期診斷MTB潛伏感染對(duì)控制結(jié)核病意義重大。目前診斷MTB潛伏感染仍沿用100年來(lái)使用的 TST，但 TST不能區(qū)分MTB感染患者和接種BCG的健康人以及感染環(huán)境中的分枝桿菌患者。Lalvani在土耳其檢查了暴露于肺結(jié)核家庭環(huán)境中的908名健康兒童。皮試結(jié)果表明580名兒童患有潛伏性肺結(jié)核,需要進(jìn)行藥物

42、治療,以免轉(zhuǎn)化為活動(dòng)性肺結(jié)核;而ELISPOT結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有380名兒童患有潛伏性肺結(jié)核。通過(guò)ELISPOT檢測(cè),只需要治療380名兒童,而不是580名,但卻能夠預(yù)防同樣數(shù)量的活動(dòng)性肺結(jié)核病例發(fā)生。因此，ELISPOT 比TST篩選結(jié)核潛伏感染更有效,而且ELISPOT檢測(cè)結(jié)果與MTB的接觸程度相關(guān)性更強(qiáng)。,ELISPOT早期技術(shù)評(píng)估 英國(guó)Ewer等用ELISpot檢測(cè)對(duì)結(jié)核分枝桿菌分泌的抗原有特異性反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞來(lái)診斷早期

43、結(jié)核病。這項(xiàng)研究共納入了結(jié)核流行區(qū)有不同程度結(jié)核病接觸史的535名學(xué)生，結(jié)果顯示結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)和ELISpot的一致性達(dá)89%(P<0.0001)。但ELISpot與研究對(duì)象結(jié)核病接觸程度之間的正相關(guān)性顯著強(qiáng)于TST。在接種過(guò)BCG的兒童中，TST假陽(yáng)性的可能性較大，而BCG接種對(duì)ELISpot結(jié)果沒(méi)有影響。作者認(rèn)為ELISpot可開始替代TST，這將使更多的人能在感染仍處于隱匿期時(shí)就可進(jìn)行預(yù)防，而不至于發(fā)展成為嚴(yán)重的

44、結(jié)核病。,ELISPOT法的優(yōu)點(diǎn),(1)靈敏、特異，能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中測(cè)出1個(gè)分泌INF細(xì)胞；只有MTB和少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌才會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，而BCG及多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌因不分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，因此本法能區(qū)別BCG接種出現(xiàn)的陽(yáng)性反應(yīng)。 (2)快速：能早期診斷結(jié)核感染，檢測(cè)全過(guò)程2天。 (3)應(yīng)用面廣：在肺結(jié)核、肺外結(jié)核及免疫抑制的結(jié)核患者均能檢測(cè)。 (4)療效評(píng)估：當(dāng)結(jié)核菌被消滅后，效應(yīng)T淋巴細(xì)

45、胞即消失，測(cè)定效應(yīng)T淋巴細(xì)胞也可檢測(cè)機(jī)體是否清除了結(jié)核菌，進(jìn)行臨床療效評(píng)估 。,ELISPOT技術(shù)的缺點(diǎn),細(xì)胞培養(yǎng)及抗原刺激時(shí),有發(fā)生細(xì)菌污染的可能,以致實(shí)驗(yàn)失敗; 實(shí)驗(yàn)過(guò)程步驟較多,實(shí)驗(yàn)人員需有一定的理論基礎(chǔ)并經(jīng)多次操作的培訓(xùn)方能勝任; 目前試劑價(jià)格比較昂貴。,結(jié)束語(yǔ),結(jié)核病準(zhǔn)確、快速的診斷是結(jié)核病防治人員多年期盼的。隨著科技不斷進(jìn)步，今天企盼已經(jīng)成為可能。經(jīng)過(guò)不斷的對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)化和繼續(xù)努力開發(fā)更新的技術(shù)，相信未來(lái)的結(jié)核病實(shí)