結(jié)核病有關(guān)新進(jìn)展

1、結(jié)核病有關(guān)新進(jìn)展 西南醫(yī)院呼吸科 胡建林,結(jié)核病一直是發(fā)展中國(guó)家較嚴(yán)重的傳染病，1985年以來(lái)艾滋病的流行、結(jié)核感染者的涌入等原因便美國(guó)等歐美發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)核病發(fā)病率呈回升趨勢(shì)，尤其是結(jié)核病耐藥問題使結(jié)核病治療更是雪上加霜。目前全世界有結(jié)核病人約2000萬(wàn)，每,年新增結(jié)核病人800～1000萬(wàn)，每年死亡人數(shù)約300萬(wàn);我國(guó)的結(jié)核病疫情也相當(dāng)嚴(yán)重，2000年第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明我國(guó)有結(jié)核病人500萬(wàn)，每年死亡人數(shù)約2

2、3.8萬(wàn)，結(jié)核病死亡在我國(guó)各種死亡原因中居第十一位，在傳染病中,居第一位。1993年世界衛(wèi)生組織(WHO)采用特別步驟宣布結(jié)核病全球告急。面對(duì)這種嚴(yán)峻的形勢(shì)，結(jié)核病的預(yù)防和治療已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。,簡(jiǎn)述： 結(jié)核病DNA疫苗 結(jié)核病診斷分型 診斷方法進(jìn)展 抗結(jié)核藥物進(jìn)展 結(jié)核病耐藥問題,結(jié)核病DNA疫苗,目前用于結(jié)核病預(yù)防的疫苗是卡介苗(BCG)，它自1921年以來(lái)就一直被用于人類結(jié)核病的預(yù)防，但經(jīng)過半個(gè)

3、多世紀(jì)的臨床對(duì)照試驗(yàn)研究，BCG對(duì)肺結(jié)核的免疫保護(hù)力是0～80%，差異很大，1995年WHO總結(jié)出BCG不是預(yù)防肺結(jié)核的有效疫苗。,此外，對(duì)于免疫功能缺陷的病人，BCG接種有可能導(dǎo)致全身播散。因此，有必要研制新疫苗。,1990年Wolff等在一次基因治療的實(shí)驗(yàn)研究中意外地發(fā)現(xiàn)不加任何處理的基因也可在骨酪肌細(xì)胞中表達(dá)蛋白至少2個(gè)月。1992年Tang等報(bào)道人生長(zhǎng)激素編碼基因的重組質(zhì)粒接種小鼠后，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗人生長(zhǎng)激素抗體。1993年U

4、lmer等首先,報(bào)道用甲型流感病毒基因免疫小鼠，不僅可表達(dá)蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，還可保護(hù)小鼠抵抗異株流感病毒的攻擊。至此，產(chǎn)生了核酸疫苗(Nucleic Acid Vaccine)或基因疫苗(Genetic Vaccine )、基因免疫(Genetic immunization)、核酸免疫,(Nucleic Acid Immuniztion)的全新概念，開創(chuàng)了免疫學(xué)和疫苗學(xué)的新領(lǐng)域。,核酸疫苗(Nucleic Acid Im

5、muniztion)包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的編碼基因和真核表達(dá)載體構(gòu)建而成，它被注入機(jī)體后，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)蛋白抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答和,體液免疫應(yīng)答，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。由于RNA疫苗不穩(wěn)定，在體內(nèi)存在時(shí)間短，表達(dá)短暫，生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸比DNA疫苗要求高, 因此，目前研究最多的是DNA疫苗，其不需要任何化學(xué)載體，故又稱為裸DNA疫苗（Naked DNA Vacci

6、ne）,。幾個(gè)流感、艾滋病、乙型肝炎、瘧疾、結(jié)腸癌、T細(xì)胞淋巴瘤等DNA疫苗在美國(guó)和歐洲已進(jìn)入Ⅰ或Ⅱ期臨床試驗(yàn)。1996年以來(lái)WHO將結(jié)核病核酸疫苗研究列為資助的項(xiàng)目之一。,一、結(jié)核病DNA疫苗的研究現(xiàn)狀,DNA疫苗可誘導(dǎo)全面的免疫反應(yīng)，尤其是特異性CTL可識(shí)別、殺傷、破壞被感染的細(xì)胞及清除細(xì)胞內(nèi)的病原體，這對(duì)于消除寄生于巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分支桿菌非常有意義。結(jié)核病DNA疫苗的研究正日益深入。,(一)結(jié)核病預(yù)防性DNA疫苗,迄今大約有以下

7、結(jié)核病預(yù)防性DNA疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了較理想的效果。,1．Ag85復(fù)合物編碼基因； 2．Pst S編碼基因；3．ESAT6編碼基因和MPT64編碼基因； 4．65kDa熱休克蛋白(hsp60)編碼基因； 5．Hsp70編碼基因； 6．36kDa編碼基因； 7．19kDa或ahpC編碼基因; 8.22kDa編碼基因; 9.HsplO編碼基因;,(二)結(jié)核病治療性DNA疫苗,目前用于結(jié)核病治療的免疫調(diào)節(jié)

8、劑主要有二類:一類是非特異性的如IFN-Y、IL-2、IL-l2等細(xì)胞因子;另一類是特異性的母牛分支桿菌菌苗(商品名維卡菌苗)，是由母牛分支桿菌經(jīng)高溫滅活后凍千制成的。由于前者半衰期短，費(fèi)用高;而后者,是死菌只能誘導(dǎo)體液免疫和Thl型細(xì)胞應(yīng)答;不能誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答。DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)生成內(nèi)生性抗原，不僅能誘導(dǎo)體液免疫和Thl型細(xì)胞應(yīng)答，還能誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答。因此，結(jié)核病DNA疫苗不僅有可能成為結(jié)核病預(yù)防性疫苗，還可能成為治療性疫

9、苗。,1999年Lowrie等首次將hsp6O、hsp7O和ESAT6質(zhì)粒DNA疫苗用于小鼠結(jié)核病模型的治療，以BCG質(zhì)粒載體和生理鹽水為對(duì)照，hsp6O和hsp7ODNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-7水平顯著高于BCG、質(zhì)粒載體和生理鹽水對(duì)照組，并使免疫小鼠脾、肺菌落計(jì)數(shù)顯,著低于其它各組;但ESAT-6DNA疫苗的治療效果不是很明顯。hsp6ODNA疫苗還可使結(jié)核病化療后體內(nèi)殘余的菌數(shù)顯著減少。該研究結(jié)果證明了某些結(jié)核病DNA疫苗作為特異

10、性免疫調(diào)節(jié)劑的可能性。但I(xiàn)L-l2的表達(dá)質(zhì)粒與hsp60DNA疫苗聯(lián)合注射未,能觀察到協(xié)同效應(yīng)，其肺和脾菌落計(jì)數(shù)均比它們單獨(dú)免疫的高。,目前關(guān)于結(jié)核病治療性DNA疫苗的研究報(bào)道還不多，由于采用的小鼠模型不同，而且小鼠對(duì)結(jié)核分支桿菌不敏感，因此，各研究結(jié)果也不盡相同。,(三)制備抗血清,DNA疫苗免疫后可激起機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高效價(jià)的特異性多克隆抗體，從而為抗血清的制備開辟了一條簡(jiǎn)便、快速的新途徑。,(四)DNA疫苗可能的免疫學(xué)機(jī)

11、理,DNA疫苗的免疫學(xué)機(jī)理尚不十分清楚。結(jié)核病DNA疫苗被導(dǎo)人宿主骨酪肌細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)核菌蛋白抗原，加工后形成多肽抗原，與宿主細(xì)胞MHC I類和MHC Ⅱ類分子結(jié)合，被呈遞給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng)，從而引發(fā)特異性細(xì)胞和,體液免疫應(yīng)答。一般認(rèn)為激活Thl輔助T細(xì)胞和CD8+CTL是機(jī)體建立結(jié)核病保護(hù)性免疫所必需的。,DNA轉(zhuǎn)入肌肉細(xì)胞后引起免疫應(yīng)答的機(jī)理目前有二種假說(shuō):(1)外源性DNA在肌細(xì)胞中表達(dá)，肌細(xì)胞分泌或死亡后釋放所表達(dá)的

12、蛋白，進(jìn)入血液循環(huán)后刺激抗體產(chǎn)生。(2)骨髓來(lái)源的抗原提呈細(xì)胞(APC)攝入肌細(xì)胞局部釋放的抗原，而后通過,MHCI類分子提呈給T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)出CTL反應(yīng)。即使有了活躍的CTL存在，多數(shù)表達(dá)抗原肌細(xì)胞因其表達(dá)的MHCI類分子水平很低，不被CTL溶解破壞，從而長(zhǎng)期表達(dá)抗原，持續(xù)刺激免疫系統(tǒng)。這可能是DNA疫苗肌肉注射后能長(zhǎng)時(shí)間維持免疫的原因。,DNA疫苗具有較長(zhǎng)的免疫記憶能力，其機(jī)制尚不清楚，可能是因?yàn)樗隗w內(nèi)相當(dāng)于抗原的儲(chǔ)存庫(kù)，不僅刺

13、激免疫記憶，本身就有免疫記憶能力。Kamath等的研究表明DNA疫苗免疫后，可使分泌γ干擾素的T細(xì)胞較早出現(xiàn)，并使其反應(yīng)增強(qiáng)。,(二)DNA疫苗的安全性,DNA疫苗的安全性還存在一定爭(zhēng)議。雖然目前所有動(dòng)物模型研究均己證明DNA疫苗安全有效，但沒有足夠的依據(jù)能排除理論上可能的危險(xiǎn)性，還需進(jìn)一步建立合適的方法檢測(cè)、排除下列危險(xiǎn)性的存在。,1．可能整合人宿主細(xì)胞基因組。通過甲基化分析，酶切分析和PCR技術(shù)等研究表明，進(jìn)入骨酪肌細(xì)胞的DNA分子

14、獨(dú)立存在于細(xì)胞質(zhì)中，未發(fā)現(xiàn)復(fù)制或整合。,2．可能引起免疫系統(tǒng)功能紊亂：(l)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗自身DNA或抗自身組織細(xì)胞的抗體，引起自身免疫性疾病。，(2)少量表達(dá)的抗原可與誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體形成復(fù)合物，引起免疫抑制。(3)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異免疫耐受。,結(jié)核病診斷分型（1999年結(jié)核病分類標(biāo)準(zhǔn)）,1．原發(fā)型肺結(jié)核:為原發(fā)結(jié)核感染所致的臨床病癥，包括原發(fā)綜合征及胸內(nèi)淋巴結(jié)結(jié)核。,2．血行播散型肺結(jié)核:包括急性血行播散型肺結(jié)核(急性粟粒型肺結(jié)核)及亞急

15、性、慢性血行播散型肺結(jié)核。,3．繼發(fā)型肺結(jié)核:是肺結(jié)核中的一個(gè)主要類型，包括浸潤(rùn)性、纖維空洞及千酪性肺炎等。,4．結(jié)核性胸膜炎:臨床上己排除其它原因引起的胸膜炎。包括結(jié)核性干性胸膜炎、結(jié)核性滲出性胸膜炎、結(jié)核性膿胸。,5．其它肺外結(jié)核:按部位及臟器命名，如骨關(guān)節(jié)結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、腎結(jié)核、腸結(jié)核等。,診斷方法進(jìn)展：噬菌體裂解法快速鑒定結(jié)核分支桿菌,分支桿菌噬菌體在1947年首次分離，至今已分離出250余種。近20年來(lái)，分支桿菌噬菌體廣

16、泛用于DNA重組技術(shù)中，近年來(lái)在分支桿菌快速鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)中得以廣泛應(yīng)用。該方法的基本原理是分支桿菌噬菌體只能感染相應(yīng)的活的分,支桿菌，如待檢標(biāo)本中無(wú)相應(yīng)的分支桿菌，則噬菌體被隨后加入的殺毒劑全部殺死，故隨后加入的指示細(xì)胞因未受噬菌體感染，因此能在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)繁殖，無(wú)噬菌斑出現(xiàn);如待檢標(biāo)本中含有相應(yīng)的分支桿菌，,則噬菌體侵入菌體內(nèi)，免遭殺毒劑破壞，并在菌體內(nèi)大量增殖，最終裂解菌體，釋放出來(lái)的噬菌體即可感染指示細(xì)胞，并使指示細(xì)胞裂解

17、出現(xiàn)噬菌斑。因此，根據(jù)噬菌斑的有無(wú)，即可確定待檢標(biāo)本中是否含有相應(yīng)的活的分支桿菌。另外，由,于所用指示細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖速度快，18～24h即可觀察結(jié)果，因此本法具有快速診斷價(jià)值。,國(guó)外報(bào)道，200-300cfu/ml MTB即可以該法檢出，國(guó)內(nèi)報(bào)道1000cfu/mlMTB可被檢出，因此具有較高的靈敏度。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，只有結(jié)核分支桿菌復(fù)合群才出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，而常見NTM和常見呼吸道感染細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性。,分組 樣本數(shù) 陽(yáng)性

18、數(shù)(%)涂陽(yáng)培陽(yáng)20 19(95)涂陰培陽(yáng)21 15(71)涂陰培陰19 5(26),總之，本法快速、簡(jiǎn)便，又有很高的特異性和較高的敏感性，不失為結(jié)核病快速診斷的有效實(shí)驗(yàn)方法之一。,盡管本法將有可能成為結(jié)核病快速診斷的有效手段，但下列因素應(yīng)予注意，以免影響結(jié)果。(1)每次實(shí)驗(yàn)必須設(shè)各種對(duì)照，以保證結(jié)果的可靠性;(2)加入殺毒劑后一定要徹底搖勻，以,殺死全部噬菌體;(3)澆注平板的瓊脂溫度不要