t載體轉(zhuǎn)化連接

1、T載體轉(zhuǎn)化連接.txt41滴水能穿石，只因?yàn)樗肋h(yuǎn)打擊同一點(diǎn)。42火柴如果躲避燃燒的痛苦，它的一生都將黯淡無光。藍(lán)白斑篩選的原理分類:生物科學(xué)藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法：是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如α互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基

2、酸插入到β半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為α互補(bǔ)。由α互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物XGal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后

3、，幾乎不可避免地導(dǎo)致無α互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)1216hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。T載體：聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物的克隆運(yùn)載體，線性化后兩側(cè)3′端各多出一個(gè)脫氧胸苷酸(T)。由于PCR產(chǎn)物兩側(cè)3′端通常含單個(gè)脫氧腺苷酸(A)，與T載體之間的AT互補(bǔ)性可提高PCR產(chǎn)物克隆的效率。感受態(tài)細(xì)胞制備注意事項(xiàng)：1、

4、制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作，同時(shí)注意近火無菌操作，防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。2、42度熱處理時(shí)很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準(zhǔn)確。3、菌液涂皿操作時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)來回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。1調(diào)整期：細(xì)菌代謝活躍，大量合成細(xì)胞分裂所需的酶類、ATP以及其他細(xì)胞成分2對(duì)數(shù)期：細(xì)菌代謝旺盛，個(gè)體的形態(tài)和生理特性比較穩(wěn)定（調(diào)整期和對(duì)數(shù)期的細(xì)菌幾乎不存在種內(nèi)斗爭）3穩(wěn)定期：有害

5、代謝產(chǎn)物積累，新增細(xì)胞數(shù)目與死亡細(xì)胞數(shù)目達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，次級(jí)代謝產(chǎn)物大量積累，形成芽孢（穩(wěn)定期的細(xì)菌種內(nèi)斗爭最激烈）4衰亡期：細(xì)菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)畸形細(xì)菌（衰亡期的細(xì)菌和無機(jī)環(huán)境的斗爭最激烈）(二)對(duì)數(shù)期(logphase)對(duì)數(shù)期又稱指數(shù)期(exponentialphase)。在此期中，細(xì)胞代謝活性最強(qiáng)，組成新細(xì)胞物質(zhì)最快，所有分裂形成的新細(xì)胞都生活旺盛。這一階段的突出特點(diǎn)是細(xì)菌數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增加，代時(shí)穩(wěn)定，細(xì)菌數(shù)目的增加與原生質(zhì)總量的增