t載體-b載體與pcr克隆困擾

1、T載體B載體與PCR克隆困擾盤古基因李萬波PCR技術(shù)給基因工程帶來了巨大的變革，生物學家可以配合DNA內(nèi)切酶隨意放大、克隆基因。一、T載體與B載體PCR產(chǎn)物的克隆技術(shù)也得到了長足發(fā)展，TA克隆載體（簡稱“T載體”）就是上世紀末發(fā)展起來的。Taq酶是第一個被克隆的嗜熱菌DNA聚合酶，由于發(fā)現(xiàn)了Taq酶具有不依賴DNA模板的核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶活性，能夠給雙鏈DNA的3’末端添加1個堿基，所以TA克隆技術(shù)應(yīng)運而生。Taq酶在dNTP俱全的情況下

2、，優(yōu)先添加1個A堿基（3’AProtruding）當只有其它某個堿基時，她就退而求其次，也能加上1個其它堿基，比如“dTTP”。PCR產(chǎn)物的平端連接效率本來很低，這是因為常規(guī)合成的寡核苷酸引物5’端不帶磷酸，T4DNA連接酶只能將DNA鏈的3’OH和另一DNA鏈的5’P(磷酸基團)相連。DNA內(nèi)切酶切開的平末端5’帶有磷酸基，只有這條鏈能與PCR產(chǎn)物的3’OH發(fā)生連接反應(yīng)，另一條鏈沒有粘性。TA克隆時也一樣，只能連接單鏈，另一條鏈上的缺

3、口（Nick）需要受體菌（HostBacteria）體內(nèi)的激酶和連接酶幫助修補，才能成為完整的環(huán)狀質(zhì)粒，完成滾環(huán)復(fù)制，抵抗篩選壓（抗生素毒性）。所以，如果質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌后的37℃溫育不夠1小時，菌落數(shù)是會減少的。上世紀80年代，拓撲異構(gòu)酶1B的發(fā)現(xiàn)使得PCR產(chǎn)物的平端克隆技術(shù)（BluntendcloningvectB載體）取得了巨大改進。拓撲異構(gòu)載體對平末端的連接速度和效率至今無可匹敵。這類載體有盤古基因的pACK4a系列、原3、嵌合

4、分子PCR酶：如NEB的Phusion，PangoGene的Paq等，這類PCR酶集保真性、速度、長度于一身，保真性強于Taq，擴增長度可達8～10kb。4、混合PCR酶（BlendDNAPolymerase）：高保真酶由于3’→5’外切酶活性，“能進能退“，常常進3步退2步，所以，其總體聚合速度慢（30～60basessec），但其具有修改錯誤的能力；Taq酶的聚合速度快（80～120basessec）但”不細心“，常常拿錯了堿基，一

5、旦發(fā)生了摻入錯誤，她就會停下來等待，由于其沒有3’→5’外切酶活性，所以，要么就”將錯就錯“摻入，要么就撒手逃跑，留下沒有完成的殘缺鏈。但如果與高保真酶配合，其高速度得以實現(xiàn)，Taq酶是長跑健將，高保真酶充當交通警察，兩者合并，實現(xiàn)了高速度和長度的優(yōu)勢。5、融合蛋白PCR酶：這類酶是PCR酶與DNA結(jié)合蛋白的基因融合的產(chǎn)物，融合的PCR酶可以是純一酶，亦可以是嵌合酶。這類PCR酶的最大特點是快！超快?。⊥瑫r還提高了保真性。這類酶有fPa