重組體的篩選與鑒定

1、第六章 重組體的篩選與鑒定,轉(zhuǎn)化子：在DNA分子克隆中，通常將導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子；重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子；期望重組子（目的重組子）：含有外源目的基因的重組子。,*為什么要進(jìn)行篩選和鑒定？（1）不帶任何外源DNA插入片段，僅由線形載體分子自身連接形成的環(huán)狀分子；（2）由一個(gè)載體分子和數(shù)個(gè)外源DNA片段組成的重組分子；（3）單純由數(shù)個(gè)外源DNA片段連接而成的多聚DNA分子；,轉(zhuǎn)化后的克隆

2、群體：,,,,,,,,,,,,,,,,,*鑒定的方法有哪些？載體表型選擇法根據(jù)插入序列的表型特征選擇DNA電泳檢測(cè)法核酸雜交檢測(cè)法免疫化學(xué)檢測(cè)法轉(zhuǎn)譯篩選法,第一節(jié)、載體表型選擇法,根據(jù)載體所攜帶的標(biāo)記基因的表型進(jìn)行選擇。一、抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法二、?-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法,一、抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法,插入效應(yīng):外源DNA片段與載體特定部位連接后，使載體的相關(guān)功能發(fā)生改變，為重組子的篩選提供信息。 插入

3、失活 插入表達(dá),,抗藥性插入失活指的是外源DNA插入載體的抗藥性篩選標(biāo)記中，導(dǎo)致該基因結(jié)構(gòu)破壞而失活，使細(xì)胞喪失對(duì)抗生素抗性的功能。,,,transfer of colonies,+ampicillin,+ ampicillin+ tetracycline,這些克隆是有重組質(zhì)粒的細(xì)菌,,,,二、?-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法,在LacZ體系中，兩個(gè)彼此互補(bǔ)的突變基因各自編碼產(chǎn)生的多肽產(chǎn)物均無活性，但兩個(gè)突變體間通過α肽互補(bǔ)作用

4、可呈現(xiàn)有功能的β-半乳糖苷酶活性，進(jìn)而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）而產(chǎn)生深藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。,當(dāng)外源基因DNA片段插入載體中LacZ’ α肽區(qū)段的多克隆位點(diǎn)后，會(huì)阻斷α序列的讀碼結(jié)構(gòu)，使其編碼的α肽失去活性，使重組子所在的細(xì)菌不能完成α-互補(bǔ)而形成白色菌落。根據(jù)這種β-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，可以檢測(cè)和篩選出攜有外源基因重組子克隆。此法又稱藍(lán)白篩選法。,,,,,第二節(jié)、根據(jù)插入序列的表型特征選

5、擇,根據(jù)克隆片段為寄主提供的新的表型特征選擇重組體DNA分子,例如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在無Leu培養(yǎng)基中不生長(zhǎng),當(dāng)含Leu外源基因在此缺陷菌中表達(dá)時(shí)可生長(zhǎng)，以此來篩選陽(yáng)性克隆。,*局限性：克隆的DNA片斷是一個(gè)完整的基因序列 能在原核生物中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá),第三節(jié)、DNA電泳檢測(cè)法,一、直接電泳檢測(cè)法二、酶切電泳篩選法三、PCR擴(kuò)增檢測(cè)法,一、直接電泳檢測(cè)法,菌落 提取質(zhì)粒 單酶切 電泳適于插入片

6、段較大的重組子初篩,,,,二、酶切電泳篩選法,經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)粒或重組噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷。,三、PCR擴(kuò)增檢測(cè)法,利用外源DNA插入位點(diǎn)兩側(cè)存在的特定序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)外源DNA進(jìn)行PCR分析。,電泳檢測(cè)法,凝膠電泳檢測(cè),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,加樣孔,,DNA Marker,空質(zhì)粒,重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒酶切,重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段,第四節(jié)、核酸雜交檢測(cè)法,一

7、、原理 具有一定同源性的兩條核酸單鏈（DNA或RNA）在適宜的溫度和離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則高度特異的復(fù)性形成雙鏈。,二、核酸雜交檢測(cè)方法,,1.核酸探針 概念：核酸探針是指帶有標(biāo)記的與目 的基因同源互補(bǔ)的一段核苷酸序列。 大?。洪L(zhǎng)度以50-300個(gè)堿基為宜 種類：DNA探針、CDNA探針、RNA探針,2.探針標(biāo)記物㈠ 放射性標(biāo)記物 常用的有32P、35S;㈡ 非放射性標(biāo)記物 常用的有

8、生物素、地高辛和熒光素等。,3.核酸雜交方法 液相雜交 固相雜交,,4．雜交膜的選用 硝酸纖維素膜:本底淺，與小片段核酸(<200bp)結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作；尼龍膜:韌性好，耐用，結(jié)合力強(qiáng)，可與小至10 bp的片段共價(jià)結(jié)合。,5.固相核酸雜交的主要過程： 1）核酸的變性；2）變性核酸在膜上的固定；3）預(yù)雜交；4）雜交；5）洗膜；6）結(jié)果顯示。,1）菌落雜交或噬菌體雜交

9、 把生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，以從成千上萬的菌落或噬菌斑中鑒定出含有重組體分子的菌落或噬菌斑的方法。 *適于從基因文庫(kù)中篩選目的基因,6.幾種常用固相核酸雜交方法,菌落雜交篩選法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2）Southern雜交 提取總DNA 酶切 瓊脂糖凝膠電泳 堿變

10、性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交,,,,,,,3） Northern印跡雜交 (Northern blot hybridization)： *不能采用堿變性法。 *常采用甲醛、聚乙二醛、二甲基亞砜、甲基氫氧化汞等變性方法。,4.斑點(diǎn)雜交(dot hybridization)： 直接將變性DNA樣品點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，固定好后再進(jìn)行雜交。,（1）DNA斑點(diǎn)雜交（2）RNA斑點(diǎn)雜交（3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)

11、雜交,Control,樣品,標(biāo)記探針濃度檢測(cè),,四類核酸分子雜交法的技術(shù)路線比較,,第五節(jié)、免疫化學(xué)檢測(cè)法,一、放射性抗體檢測(cè)法二、免疫沉淀檢測(cè)法三、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）四、免疫印跡（western blotting）法,一、放射性抗體檢測(cè)法,1、原理： ① 一種抗原產(chǎn)生的免疫血清含有好幾種IgG抗體，分別識(shí)別抗原分子上的不同定子（決定簇），并分別同各自識(shí)別的抗原定子相結(jié)合；,② 抗體分子能夠十分牢固地吸附在固體基

12、質(zhì)(如聚乙烯等塑料制品)上，而不會(huì)被洗脫掉； ③ 通過體外碘化作用，IgG抗體便會(huì)迅速地被放射性同位素125I標(biāo)記上。,2、放射性抗體檢測(cè)法的過程,二、免疫沉淀檢測(cè)法原理 抗原——抗體凝集反應(yīng)。2.方法 把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時(shí)，就會(huì)與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。,,,,,,,,菌落,,沉淀素,,,免疫沉淀檢測(cè)法,3.缺點(diǎn)：只能檢測(cè)分泌出細(xì)胞的蛋白質(zhì)改良：采用λcI85

13、7溶原性大腸桿菌做受體細(xì)胞；將含有抗體和溶菌酶的瓊脂小心倒在菌落上。,三、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）（enzyme linked immunosorbent assay）①固相的抗原或抗體；②酶標(biāo)記的抗原或抗體；③酶作用的底物。,1. 原理：一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（secondary antibody）： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶

14、連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。,,待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,酶,待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,,,,,無色的底物,有色的產(chǎn)物,,,,比色觀察,酶,2. ELISA檢測(cè)的一般步驟（1）固定樣品：將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干

15、燥后就被固定在孔底。,孔底,（2）一抗結(jié)合：加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。,一抗,,,,（3）二抗結(jié)合：加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗。,二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。,二抗,,,,（4）顯色反應(yīng)：加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。,,（5）比色：在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。,四、免疫印跡法（western blotting）

16、 1、蛋白質(zhì)的電泳分離------SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),,點(diǎn)樣,電泳方向,凝膠中的蛋白質(zhì)的染色：考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。硝酸銀： 靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,2、將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上——轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)移常用的膜：硝

17、酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等。,Western裝置,3、免疫學(xué)檢測(cè)——原理與ELISA相同,待測(cè)蛋白,硝酸纖 維素膜,一抗,二抗,辣根過氧 化物酶,底物,產(chǎn)物(顯色),,PAGE膠,,待測(cè)蛋白,辣根過氧化物酶：HRPO,第六節(jié)、轉(zhuǎn)譯篩選法一、無細(xì)胞翻譯系統(tǒng) 指保留蛋白質(zhì)生物合成能力的細(xì)胞抽取物 。,用于蛋白質(zhì)的生物合成研究的體外翻譯系統(tǒng)主要有： *大腸桿菌無細(xì)胞翻譯系統(tǒng) *兔網(wǎng)織

18、紅細(xì)胞無細(xì)胞翻譯系統(tǒng) *麥胚無細(xì)胞翻譯系統(tǒng),二、轉(zhuǎn)譯篩選1、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法 適用于篩選那些高豐度的mRNA 2、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法 可用于檢出低豐度mRNA,1、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法原理：mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。,單鏈mRNA,核糖體 小亞基,核糖體 大亞基,,能翻譯,mRNA,DNA,核糖體 小亞基,核糖體 大亞基,不能翻譯,過程,2

19、、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對(duì)應(yīng)的mRNA，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫原性等）。,過程,硝酸纖 維素濾膜,載體和插 入的cDNA,總mRNA,,,cDNA基因的 mRNA,,,,雜交,,洗脫,cDNA基因的 mRNA,體外翻譯,,cDNA編碼的蛋白,,電泳,,,凝膠放射自顯影,,cDNA編 碼的蛋白,硝酸纖