關(guān)于細(xì)胞復(fù)蘇

1、關(guān)于細(xì)胞復(fù)蘇關(guān)于細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞冷胞冷凍保存與復(fù)保存與復(fù)蘇原理原理三木三木轉(zhuǎn)自體外培養(yǎng)的原理和技術(shù).薛慶善主編.2001年2月.科學(xué)出版社pp128136細(xì)胞冷凍保存與復(fù)蘇原理細(xì)胞冷凍保存與復(fù)蘇原理在低于700C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股顒?dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就

2、是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于700C的超低溫條件），并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞

3、膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生

4、冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，12分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長(zhǎng)的時(shí)間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)

5、構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。冷凍速率冷凍速率冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過程中會(huì)發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至50C時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至5～150C之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能

6、。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動(dòng)的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會(huì)發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。Luyet（1973）證實(shí)液體的凝固可分為兩

7、種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過慢時(shí)，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過一定程度時(shí)即失去活性。同時(shí)冷凍速度過慢，還會(huì)引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會(huì)形成較到冰晶，造成細(xì)胞膜及細(xì)

8、胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對(duì)細(xì)胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對(duì)細(xì)胞膜后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑。冷凍保存方法冷凍保存方法按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至700C～800C，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至

9、1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。但目前細(xì)胞凍存最常用的仍是前一種方法。非玻璃化凍存方法非玻璃化凍存方法下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例，介紹非玻璃化凍存細(xì)胞的詳細(xì)過程。主要材料主要材料（1）儀器設(shè)備：普通冰箱、300C低溫冰箱和700

10、C～800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機(jī)、電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀等；（2）凍存管：容量為1ml或1.5ml；（3）冷凍保護(hù)液：一般是以9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成。現(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；（4）待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。操作過程操作過程1.待凍存細(xì)胞懸液的制備(1)按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；(2)將細(xì)胞懸液以

11、800～1000rmin離心5min，去上清夜；(3)向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1106～1107個(gè)ml；(4)按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；(5)再凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。2.分級(jí)冷凍(1)先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），約40min；(2)接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（100C～200C），約30～60min；(3)將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（300C），放

12、置30min左右；(4)然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（700C～800C），過夜；(5)最后將凍存管投入液氮保存。3.記錄做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。凍存結(jié)果凍存結(jié)果如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。討論討論在使用DMSO前，不要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制時(shí)