工業(yè)廢水活性污泥中PHA生產(chǎn)菌種的篩選與發(fā)酵優(yōu)化及PHA合酶的生物信息學分析.pdf

1、聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是由細菌合成的一種胞內(nèi)聚酯，普遍存在于自然界細菌體內(nèi)?，F(xiàn)如今傳統(tǒng)塑料制品所帶來的白色污染和石油資源面臨枯竭的問題日益嚴重，因此PHA作為可替代傳統(tǒng)塑料的環(huán)境友好型塑料受到了越來越多的關(guān)注。但是受制予其高昂的生產(chǎn)成本一直沒得到廣泛應用。有研究發(fā)現(xiàn)活性污泥中含有大量的PHA生產(chǎn)菌，這為降低PHA的生產(chǎn)成本以及剩余污泥的資源化利用提供了前提條件。
　　本文從能夠處理環(huán)氧

2、丙烷皂化廢水的活性污泥中篩選到了一株P(guān)HA高產(chǎn)菌株。利用Biolog微生物鑒定法和16S rDNA測序方法對該菌株進行菌種鑒定，最終確定為泡囊短波單胞菌（Brevundimonas vesicularis。我們將其命名為Brevundimonas vesicularisUJN1。在此基礎(chǔ)上對UJN1的PHA合酶基因phaC進行了PCR擴增，然后對此基因進行了生物信息學分析，預測了UJN1的PHA合酶的基本理化性質(zhì)和作用機理。隨后針對Br

3、evundimonas vesicularis UJN1進行了培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，以提高其PHA的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。
　　本文主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.PHA生產(chǎn)菌株的篩選。對從工業(yè)污水處理廠取得的新鮮污泥進行馴化培養(yǎng)，采用尼羅蘭染色法對馴化后的污泥進行初步篩選，得到19株可能合成PHA的菌株。將這19株菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，分別測定其菌體干重，并用氣相色譜法檢測每株菌的PHA產(chǎn)量，選取其中生長情況較好和PHA產(chǎn)量最

4、高的菌株，命名為UJN1。
　　2.UJN1的菌種鑒定。將復篩所得的UJN1菌株進行生理生化實驗，結(jié)果表明其為革蘭氏陰性的非腸道菌。選用GN2微生物鑒定板對此菌株進行了Biolog微生物鑒定。隨后又進行了16S rDNA序列測定。通過BLAST序列比對表明此菌株與泡囊短波單胞菌有99％的同源性，由此確定了菌株UJN1為泡囊短波單胞菌(Brevundimonasvesicularis)。
　　3.Brevundimonas v

5、esicularis UJN1 PHA合酶(編碼基因為phaC)的生物信息學分析。設(shè)計了phaC引物，通過PCR方法克隆得到Brevundimonas vesicularis UJN1 phaC基因序列，并將其成功測序。對phaC基因的開放閱讀框、編碼蛋白序列的理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)域、信號肽、結(jié)構(gòu)域分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了生物信息學分析。結(jié)果表明該基因ORF長1731 bp，編碼576個氨基酸，所編碼蛋白質(zhì)的等電點為5.40。在組成蛋

6、白質(zhì)的20種氨基酸中，丙氨酸(Ala)所占的比例最高，達到14.2％;不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為36.13，為穩(wěn)定蛋白且有較好的親水性。菌株UJN1的PHA合酶可歸屬為Ⅰ型，我們簡單的分析了這一PHA合酶的生理生化特征、預測了其合成PHA的機理，這為這一PHA合酶的進一步功能鑒定，表達調(diào)控和轉(zhuǎn)基因克隆等研究提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　4.Brevundimonas vesicularis UJN1生產(chǎn)PHA的條件優(yōu)化。對篩得的PHA合

7、成菌株Brevundimonas vesicularis UJN1進行了培養(yǎng)基成分（碳源、氮源、碳氮比）和發(fā)酵條件（培養(yǎng)時間、初始pH、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量等）的優(yōu)化。同時在完成單因素影響實驗的前提下，進行了多因素交互影響實驗以獲得最適的發(fā)酵條件。實驗確定了最適的碳源蔗糖與氮源氯化銨的比例為100/1.04，培養(yǎng)基初始pH為6.7，最適培養(yǎng)溫度為33.4℃。經(jīng)過48 h的發(fā)酵培養(yǎng)能夠得到占細菌干重34.1％的PHA。結(jié)果顯