一氧化氮在利多卡因致大鼠中毒驚厥過程中的作用.pdf

1、目的：應用利多卡因致大鼠中毒驚厥模型，測定中毒驚厥過程中海馬CA1區(qū)細胞外液一氧化氮含量，并應用一氧化氮合酶阻滯劑7-硝基吲哚(7-NI)，觀察nNOS的活性以及一氧化氮含量的變化，探討一氧化氮在利多卡因致大鼠中毒驚厥過程中的作用機制。 方法：健康雄性Wistar大鼠24只，體重250±20g(河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供)。隨機隨機分為3組，每組8只。大鼠異氟烷(isoflurane)麻醉后氣管插管吸氧自主呼吸。股靜脈切開置管

2、以1ml/hr的速度輸入乳酸鈉林格氏液。動物立體固定后，頭皮刺入電極持續(xù)監(jiān)測EEG。切開頭皮，用微型顱鉆在海馬CA1區(qū)(前囟(bregma)后方3.6mm和左方2mm處)打開一直徑約2mm的圓孔，將微透析探針刺入大腦皮層2mm，用乳酸鈉林格氏液以2μl/min的速度灌注，穩(wěn)定60min后收集腦組織透析液20min，之后按照實驗分組給與不同的處理。利多卡因組(L組)：給予2mg負荷劑量后，以4mg·kg-1·min-1的速度經(jīng)股靜脈持續(xù)泵

3、入利多卡因，空白對照組(S組)以相同速度泵入乳酸鈉林格氏液。7-NI組(7-NI組)：靜脈泵入利多卡因前30min腹腔內(nèi)注射30mg/kg nNOS抑制劑7-NI(7-硝基吲唑)，其它2組于相應時間點腹腔內(nèi)注射等容積生理鹽水。腹腔注射30min后繼續(xù)收集微透析液，每隔20min收集一次，共收集40min，連同最初20min的透析液一起-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。觀察驚厥波(EEG上出現(xiàn)振幅超過100μV寬大快速的脊波并持續(xù)5-10秒以上)出現(xiàn)

4、后，停止泵入利多卡因。7-NI組若不出現(xiàn)驚厥波則泵入利多卡因與預實驗中保證絕大多數(shù)大鼠出現(xiàn)驚厥波時泵入利多卡因相當(由統(tǒng)計軟件計算95％可信區(qū)間)。記錄驚厥波發(fā)生及持續(xù)時間，呼吸減弱或消失及恢復時間。標本的采集及檢測方法： (1)微透析液的收集及測定：所有組在建立了靜脈通路并固定后，用腦立體定位儀固定大鼠頭部，沿頭部中線位置剪開頭皮，分離軟組織，在前囟后方3.6mm，旁開2.0mm鉆開顱骨，挑開硬腦膜并放置透析針，以2μl/mi

5、n的速度推進微量推進泵。從微透析針出口端至收集管全程保持在0-4℃環(huán)境下，微透析液收集完后放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。微透析液用來測量CA1區(qū)一氧化氮濃度，采用CAYMAN公司的Nitrate/Nitrite Colorimetric AssayKit(Cat No780001)對NO進行微量測定，測量條件和步驟依照試劑盒說明進行。 (2)微透析液留取完畢后深麻醉下(5％異氟烷麻醉)沿肋緣剪開胸廓暴露升主動脈和心臟，提起心尖剪開

6、左心室，經(jīng)左心室插灌注針至升主動脈并固定，接灌流沖洗液和固定液(4％多聚甲醛)，同時剪開右心耳并開始推注沖洗液和固定液進行全身固定。固定完畢后斷頭，小心剝開顱骨取出全腦，取海馬所在的節(jié)段區(qū)放入固定液中4℃保存。NOS免疫組化測定采用SP法進行，按照試劑盒要求步驟依次進行，最后的標本片在光鏡下(10×40)計數(shù)5個視野的桔黃色陽性細胞數(shù)量，計算出平均數(shù)和標準差，數(shù)據(jù)以-x±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05

7、表示差異有顯著性。 結(jié)果： (1)各組間體重、心率、微透析針置入并穩(wěn)定60min及L組開始出現(xiàn)驚厥波時(其他兩組于相應時間點)兩個時間點動脈血氣指標比較差異無統(tǒng)計學意義。 (2)與S組相比，L組腦透析液中NO濃度顯著升高。與L組相比，7-NI組顯著降低，各組間比較有顯著差異。 (3)與S組相比，L組海馬CA1區(qū)nNOS陽性細胞數(shù)量顯著增多。與L組相比，7-NI組顯著減少，各組間比較有顯著差異。 (