詹氏甲烷球菌NifH1和釀酒酵母Ndl1的克隆、表達、純化及初步晶體學分析.pdf

1、1.固氮作用是由固氮菌中的固氮復合物完成的。固氮復合物由固氮酶和固氮還原酶組成，其中固氮酶是一個由NifD和NifK蛋白組成的α2β2異四聚體，固氮還原酶是一個由NifH蛋白組成的同二聚體。目前，已經在沒有固氮作用的嗜熱產烷生物詹氏甲烷球菌中發(fā)現了固氮酶NifD/K和NifH同源物的表達（命名為NflD/K和NlfH，Nfl=Nif-like，M.Jannaschii中的NlfH在這里被稱作Mj.NifH1），但是其功能還不清楚。解出M

2、j.NifH1的晶體結構將對理解其功能以及了解其在進化上的作用提供很大的幫助。
　　 在本課題中，構建了Mj.NifH1的表達載體，并通過鎳柱親和和HiLoad 16/60 SuperdeX200 size-exclusion column凝膠層析等方法得到了純化后的目的蛋白。目的蛋白通過懸滴氣相擴散法在287K進行晶體生長，并得到可以進行X射線衍射和數據收集的蛋白晶體。在上海同步輻射加速器收集到一套最高分辨率為3.3的衍射數據

3、。晶體的空間群是P4132，晶胞參數為a=b=c=139.45，確定每個不對稱單位含有一個蛋白分子。
　　 2.動力蛋白(Dynein）是一種細胞中的馬達蛋白，可以將包含ATP在內的化學能轉換為運動過程中的機械能，在有絲分裂、膜轉運和胞內運輸中起著關鍵作用。動力蛋白作用的發(fā)揮需要許多蛋白的共同協(xié)調作用，如NUDEL家族中的一員Ndl1，對于動力蛋白正常地定位到動粒上非常關鍵。Ndl1可以激活動力蛋白調節(jié)的蛋白轉運，而當它結合到分

4、裂激素和動力蛋白時，可以穩(wěn)定動力蛋白或動力蛋白激活蛋白，使其不會進行微管依賴的脫落過程，從而進一步產生分子馬達的作用。Ndl1缺失時會導致結合到微管正極的動力蛋白減少，從而影響有絲分裂等過程。
　　 在本課題中，為獲得釀酒酵母中Ndl1蛋白(Sc.Ndl1)的晶體結構，為進一步了解其發(fā)揮功能的分子機制提供線索，構建了Sc.Ndl1的表達載體，并表達、純化得到目的蛋白，并進行晶體生長。目前得到一顆Sc.Ndl1蛋白晶體，晶體優(yōu)化正